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标题: 【求助】marker为什么会越跑越宽？ [打印本页]

作者: loli 时间: 2014-6-20 16:49 标题: 【求助】marker为什么会越跑越宽？

用的15％的胶
跑到后面就几道marker就呈梯形了
怎么回事呢？

作者: hold住 时间: 2014-6-20 16:49

两侧的空是不是空跑的，如果是，条带就容易扩散，可在空的孔里加上loading buffer

作者: loli 时间: 2014-6-20 16:50

两侧都有蛋白，每孔30ug蛋白上样量

作者: glass 时间: 2014-6-20 16:50

QUOTE:

原帖由 loli 于 2014-6-20 16:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

用的15％的胶
跑到后面就几道marker就呈梯形了
怎么回事呢？

小分子的蛋白相对单分子的蛋白来说容易扩散，比如溴芬兰，跑一段时间会连成一条线。你可以观察你的marker，分子量越大的蛋白跑的带越窄，而后几条带无论纵向还是横向都相对较宽。15%的胶跑的相对较慢。

作者: xue258 时间: 2014-6-20 16:51

QUOTE:

原帖由 glass 于 2014-6-20 16:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

小分子的蛋白相对单分子的蛋白来说容易扩散，比如溴芬兰，跑一段时间会连成一条线。你可以观察你的marker，分子量越大的蛋白跑的带越窄，而后几条带无论纵向还是横向都相对较宽。15%的胶跑的相对较慢。 ...

某也来补充一句
主要原因之一是marker性能不好。每个预染蛋白条带分子量稍微有些差异，不是完全的一致，所以中、小分子量marker会有梯形改变（大分子量也不是绝对的条带，跑低一点浓度的分辨率低的胶就可以看出来），为相差不多的markers造成（如果marker稍有降解就更明显了）。我是这么理解的：中小分子量更容易受到影响。比如1kd的差异，对于14.4kd的marker影响就很大导致条带迁移不均形成梯形；对于117kd的marker则影响很小，1kd的差异胶上是很难反映出来的。若为彩色marker因均一性好则很少出现这种情况，都是一条线。

作者: loli 时间: 2014-6-20 16:51

我有一个疑问
为什么同样的marker
同一个电泳槽同时跑胶
10%的那板跑得就很正常，每道的宽度是一样的
可是15%的胶却变成梯形了呢？
这两板溴酚兰跑到底的时间是一样的
如果是说扩散的话
也应该是一样程度的扩散啊

作者: star#room 时间: 2014-6-20 16:51

15%的胶跑的慢会扩散一点的不过marker的质量同样重要

作者: xue258 时间: 2014-6-20 16:52

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原帖由 loli 于 2014-6-20 16:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我有一个疑问
为什么同样的marker
同一个电泳槽同时跑胶
10%的那板跑得就很正常，每道的宽度是一样的
可是15%的胶却变成梯形了呢？
这两板溴酚兰跑到底的时间是一样的
如果是说扩散的话
也应该是一样程度的扩散啊 ...

10% 和15%胶条带分布是有差别的。10%胶看到的条带的分子量肯定远大于15%胶，不要被条带迷惑了。10%胶中间位置的条带在15%上就在中上面了；15%中间的条带在10%胶上肯定在中下端。15%下端的条带在10%的胶上根本就分不出来，就和溴芬兰纠成一片。你自己好好检查10%的胶，去看看胶的前端条带跑成什么样子。再看看15%胶的大分子量，看看条带是不是很好，是不是没有融和。
另外扩散也只会发生在横向条带的融合，纵向有两端电压控制，怎么会扩散？要是纵向扩散那电泳还有什么意义？还分什么条带？？？？？？？？自己想一想去，纵向扩散有可能吗？？？你能相信吗？？？？？？？？？
我已经说过是marker的均一性不好。要是不相信，就花个上千块钱买个进口的彩色marker试试。

作者: xue258 时间: 2014-6-20 16:52

QUOTE:

但对上述观点有质疑，已经在上面一楼的帖子中说了，在此就不赘述了。总体同意横向扩散，但认为纵向条带即使增宽也不是条带扩散引起的，而是胶分辨率引起的分子量相似的蛋白被分开导致的。条带窄也是因为分辨率低致使分子量类似的条带没有分开形成的，而不是条带没有扩散或者扩散的慢形成的。因为分子量类似的蛋白多着呢，跑在同一位置的也不为怪，分辨率高的话分开也是应该。

作者: loli 时间: 2014-6-20 16:53

楼上所谓的纵向条带宽和窄是从溴酚兰看出来的么？

作者: xue258 时间: 2014-6-20 16:53

QUOTE:

原帖由 loli 于 2014-6-20 16:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼上所谓的纵向条带宽和窄是从溴酚兰看出来的么？

不是，无论横向和纵向都是指蛋白条带（包含marker）。横向融合在蛋白上样量极大时出现的更明显，这个大家都深有体会。
溴酚兰经常发现扩散，但它仅是个电泳的指示剂，其扩散与本身的质量好坏成反比，和本身含量高低成正比，和时间成正比，不能全然代表蛋白的泳动情况，也不能反映蛋白的横向扩散情况。蛋白的纵向改变与扩散没有关系，靠两端电压（泳动动力，是蛋白迁移的基础）和胶阻力（孔径阻力，是蛋白分离的基础，与胶浓度成正比，与蛋白分子量成正比）二者维持。

作者: cwcwcww 时间: 2014-6-20 16:53

个人认为纵向扩算是肯定存在的，但是纵向扩算并不是楼主问的问题的关键所在，
纵向扩散主要是由于胶的孔径大小不一引起的，但是这种差别并不大，但是如果是比较长的胶，这种作用累积起来就可以发现胶的条带变宽
成梯形我觉得主要是横向扩散引起的，在电泳过程中，离子运动是有电场作用的电泳的方向和自身热运动的方向叠加而成的，想抑制条带变宽变型这里可以采用降低电泳温度（在冰浴中电泳）在旁边的孔道中加入蛋白的方法减弱横向扩散。

作者: qhyu 时间: 2014-6-20 16:54

我们用的都是进口预染marker，可是我做的也是有时候会括有时候跑的不错。

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