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标题: 【求助】】SDS-PAGE蛋白样品积压在上层胶和下层胶分界... [打印本页]

作者: KGZ564 时间: 2014-6-21 09:38 标题: 【求助】】SDS-PAGE蛋白样品积压在上层胶和下层胶分界...

昨天跑蛋白电泳，上层胶4%，PH6.8，下层胶15%，PH8.8，电泳结束后发现目的蛋白条带非常细，大部分都积压在上层胶和下层胶的中间，考染颜色很深，不知道是什么原因，今天又跑了一次，就比较正常了。
问了很多人，大部分也都经历过这种情况，都说再跑一遍就好了，但是由于不知道原因心里一直没底，希望各位大侠不吝赐教，小弟多谢了

作者: wmp1234 时间: 2014-6-21 09:38

我觉得像是目的蛋白样品的问题，有可能是样品太粘稠了或是有不溶性的东西，不易跑进分离胶。

作者: bs4665 时间: 2014-6-21 09:38

可能是你加上层胶的时候之前没把压下层胶的水或酒精吸干净,导致上下两层胶之间形成比较厚的水带

作者: dog002 时间: 2014-6-21 09:38

单看现象应该考虑有多聚体产生或者有其他不溶的大分子。既然后来跑正常了，应该是制胶的问题。

作者: fsdd817 时间: 2014-6-21 09:39

QUOTE:

原帖由 KGZ564 于 2014-6-21 09:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

昨天跑蛋白电泳，上层胶4%，PH6.8，下层胶15%，PH8.8，电泳结束后发现目的蛋白条带非常细，大部分都积压在上层胶和下层胶的中间，考染颜色很深，不知道是什么原因，今天又跑了一次，就比较正常了。
问了很多人，大部分也都经历过这种情况， ...

没有将分离胶的水封吸干净，就配了压缩，胶可能没有凝好的时候，就拔梳子不小心，将两层胶断开，结果样就跑不下去了。

作者: daod 时间: 2014-6-21 09:39

对两层胶中间有间隙,所以样品都积在中间了.以后操作的时候不要心急哦,祝你试验顺利!

作者: KGZ564 时间: 2014-6-21 09:39

谢谢各位了
但我可以肯定不是因为中间有间隙
今天又跑了一次
特别注意电泳的小心操作
可是又发生了那种情况
哎真是郁闷
我觉得可能是样品的问题
因为我跑的marker就没有滞留的问题
但是样品是我从亲和层析下来的呀
而且上样前也离心了的
真不知道是怎么回事

作者: KGZ564 时间: 2014-6-21 09:40

我在配上层胶之前就开始用滤纸吸水封的液体了
到我配好上层胶肯定是吸的很干净了
因为我特别注意了这一点

作者: remonte 时间: 2014-6-21 09:40

样品种目的蛋白分子量有多大？变性完全了吗？

作者: KGZ564 时间: 2014-6-21 09:40

55kD,开水煮了5分钟

作者: KGZ564 时间: 2014-6-21 09:41

为了验证是不是蛋白煮了之后聚集
做了未煮的对照
结果是基本一样的
看起来未煮的或许还比煮过的强些

作者: daod 时间: 2014-6-21 09:41

55kda的蛋白跑10%的胶，您检查一下分离胶的pH值，重跑一次。

作者: dog002 时间: 2014-6-21 09:41

15％胶浓度是不是太高了，大分子蛋白跑不下来

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