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标题: 【求助】3KD以下蛋白跑不出电泳 [打印本页]

作者: duoduo 时间: 2014-6-21 09:42 标题: 【求助】3KD以下蛋白跑不出电泳

各位好，本试验碰到一难题，一33个氨基酸的多肽（原核表达）跑不出电泳来（20%Tri-glycin SDS-PAGE) ，但是提取的样品有活性。因此我们认为蛋白有表达，但就是没有电泳结果，这个难题5年都没有解决，请各位指点一下！

作者: guagua 时间: 2014-6-21 09:43

用Tricine SDS-PAGE肯定跑得出来。
因为我做过，对于1KD的短肽是有难度，但3KD的就很好作了

作者: 耗子=== 时间: 2014-6-21 09:43

可以试试夹层胶或者尿素胶
我以前跑过7kd的再低的就不知道怎么样了
你可以试试看

作者: wawa 时间: 2014-6-21 09:43

我刚刚跑过了５ＫＤ大小的蛋白．完全可以的到很好的结果．你的配方是什么？好象有几种不同的protocol．
还有你的胶跑别的小分子蛋白可以吗？如果不行．那就是你胶的问题了

作者: duoduo 时间: 2014-6-21 09:44

用Tricine SDS-PAGE也跑过了，还是没有跑出来，我们有一作7年蛋白的蛋白王子都没有u跑出来，他就是用的这种方法，还有就是20%浓度的胶液试过了

作者: duoduo 时间: 2014-6-21 09:44

用Tricine SDS-PAGE肯定跑得出来。
因为我做过，对于1KD的短肽是有难度，但3KD的就很好作了

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这个方法试过了，也没有成功。我看到有方法是提高丙烯酰胺浓度和加甘油，但不知具体方法。不知道是不是这个多肽有其他毛病，我刚接手这个东西，害怕呢，老板很凶，以前的人都挨批啊。

作者: vcve 时间: 2014-6-21 09:45

我的胶就要加甘油.效果很好。如果不行那是不是你的蛋白浓度太低了啊??我的分离胶49.5%T。6%C 。浓缩胶49.5%T。3%C

作者: flower-201 时间: 2014-6-21 09:45

中国生物工程杂志上（2004年1月）有一篇曹佐武的文章，就是用5T＋3C的方法，加尿素可以跑到1K，一般的6T＋3C＋甘油的方法跑3K很清楚，我刚跑的。你要注意的问题是：阳极缓冲液、凝胶缓冲液的PH值(测Tris的PH值的探头和一般试剂的不一样，）丙烯酰胺在4度会沉淀，用锡箔纸包的时候不容易发现，用的时候在55度加热融解。我犯了这样两个错误，一直没有跑出来，注意一下，应该可以跑出来。

作者: duoduo 时间: 2014-6-21 09:45

谢谢你啊，你采用的是6T＋3C＋甘油的方法跑3K这个方法吗，前面的5T＋3C+加尿素的方法试过吗？你说的那篇文章我也下载了。我可以将用前面2方法同时做一下。

作者: duoduo 时间: 2014-6-21 09:46

我的胶就要加甘油.效果很好。如果不行那是不是你的蛋白浓度太低了啊??我的分离胶49.5%T。6%C 。浓缩胶49.5%T。3%C

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也是配的3段胶“小孔胶+ 夹层胶+ 浓缩胶“还是 2段”分离胶+浓缩胶“。我看你的方法可能是2段胶，还有中间有需要注意的问题吗？比如PH，电极缓冲液等。不好意思，多多麻烦了。

作者: linlinstar 时间: 2014-6-21 09:46

堆积胶 0.16ml 丙烯先按 (49.5%T。3%C)
0.5ml gel buffer (3M Tris.cl 0.3%SDS ph8.45)
1.34ml ddw
10ul 10% APS
4ul TEMED
分离胶 2ml 丙烯先按 (49.5%T。6%C)
2ml gel buffer (同上)
0.62 100%甘油
1.38 ddw
40ul 10% APS
8ul TEMED
阳极电泳缓冲液 0.2M Tris.cl ph 8.9
阴极缓冲液 0.1M Tris.cl 0.1M tricine 0.1%SDS PH8.25
以上就是我的胶的配方.祝你实验顺利

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