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标题: 【求助】我的蛋白，愁死人了！ [打印本页]

作者: 7437654 时间: 2014-6-21 09:52 标题: 【求助】我的蛋白，愁死人了！

大家好！我的实验遇到一个难题，发酵液硫酸铵沉淀蛋白后，想过柱子，但是硫酸铵沉淀里面有很多不溶于水的东西，我用高速离心去掉沉淀后，上清里面也没有了我的有效物质（一块沉淀了），我用甲醇和丙酮抽提，倒是可以去掉一些杂质，但是旋转蒸发去掉醇以后，又出现一些水溶性差的东西，有效物质就在其中，到底怎么办啊？

作者: am10 时间: 2014-6-21 09:52

QUOTE:

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大家好！我的实验遇到一个难题，发酵液硫酸铵沉淀蛋白后，想过柱子，但是硫酸铵沉淀里面有很多不溶于水的东西，我用高速离心去掉沉淀后，上清里面也没有了我的有效物质（一块沉淀了），我用甲醇和丙酮抽提，倒是可以去掉一些杂质，但是旋 ...

发酵液硫酸铵沉淀蛋白后，一般还要将沉淀溶解于低浓度的buffer中（我们实验室用的是50mM Pbs含10mM NaCl），再低速离心就可以将杂质去除掉了，如果不放心可以再微滤一下，之后就可以过柱子啦！

作者: hulu呼噜 时间: 2014-6-21 09:52

硫酸铵分部沉淀试试，可能会把杂质和蛋白质分开

作者: 7437654 时间: 2014-6-21 09:53

我用了pbs，但是感觉不出有多大变化，不过我会再试试，谢谢您的指点！！！

作者: 7437654 时间: 2014-6-21 09:53

还有请问，你们的PBS的配方是什么呢？

作者: cwcwcww 时间: 2014-6-21 09:53

Stock A: 0.2M NaH2PO4.2H2O 31.2 g in 1L
Stock B: 0.2 M Na2HPO4.2H20 35.6 g in 1L
根据你的蛋白调节到适当的pH值，用前再稀释一下即可！

作者: ending 时间: 2014-6-21 09:53

你的蛋白的性质怎么样？不是所有的蛋白的能溶于PBS里面的，也许你还得加入些助溶的试剂才行。所以，你最好先把你要的蛋白大致的pI，疏水性质，是不是膜蛋白等等性质了解后就能更有效的去提取和沉淀了。

作者: 7437654 时间: 2014-6-21 09:54

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原帖由 ending 于 2014-6-21 09:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你的蛋白的性质怎么样？不是所有的蛋白的能溶于PBS里面的，也许你还得加入些助溶的试剂才行。所以，你最好先把你要的蛋白大致的pI，疏水性质，是不是膜蛋白等等性质了解后就能更有效的去提取和沉淀了。 ...

你好！我的蛋白是一种胞外代谢物，应该不是膜蛋白吧！我试过丙酮沉淀，酸沉淀，都不行，请问加助溶剂的话，加什么？谢谢您的帮助！

作者: 7437654 时间: 2014-6-21 09:54

还有就是，怎么避免蛋白的疏水作用，pH的改变可以吗？

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