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标题: 【求助】过Glutation Sepharose 4B亲和层析住后怎么有这么多.. [打印本页]

作者: 红茶可乐 时间: 2014-6-21 09:56 标题: 【求助】过Glutation Sepharose 4B亲和层析住后怎么有这么多..

如图所示，我的目的蛋白偶联GST，然后过Glutation Sepharose 4B亲和层析住纯化，怎么会有这么多杂带呢？做多抗可以吗？

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作者: jrwyyplt 时间: 2014-6-21 09:56

首先确定的是亲和的配基，如果能吸附的话，那么再确定解析条件！
你的蛋白和配基之间是共价吸附还是非共价吸附决定了解析的步骤，是增加盐浓度洗脱还是降低盐浓度洗脱，还是改变pH洗脱！
在确保目标蛋白被吸附的话，多改进解析条件吧！

作者: 红茶可乐 时间: 2014-6-21 09:57

谢谢楼上的
我想请问是除了改变盐浓度外，是不是也可以改变还原型谷胱甘肽的浓度？

作者: kswl870 时间: 2014-6-21 09:57

可以先用低浓度GSH预洗，3－5mM，然后再用10－25mM GSH洗脱
不过看你的电泳图，26kd处有两个条带，很可能是GST的片断
你的目标蛋白是35kd的那个吗？是否需要做酶切还是纯化融合蛋白就可以了呢？
GST蛋白亲和层析的确容易产生杂带，而且如果发生表达终止，即产生GST片段的话就比较麻烦了
能否具体说说你的纯化条件呢

作者: 红茶可乐 时间: 2014-6-21 09:57

我的纯化条件是用10mMGSH溶在50mMTris里洗脱目的蛋白的（就是35kd那个），我只需要纯化融合蛋白，让后做多抗用。

作者: kswl870 时间: 2014-6-21 09:58

如果你只要融合蛋白的话，从电泳图来看，这个纯度恐怕不行
26kd的是GST片断，同样亲和在凝胶上，比较麻烦
或者再多制备一些，然后用离交柱分离试试

作者: jrwyyplt 时间: 2014-6-21 09:58

用亲和分不开的话，试试G50

作者: 红茶可乐 时间: 2014-6-21 09:59

忙活了几天，可结果仍不理想Sad
用梯度浓度还原型谷胱甘肽洗脱（1mM、2.5mM、5mM、10mM）都试了，还是同时洗下来，然后又试了HiPrep 16-60 Sephacryl S-200 ，结果还是没分开，这个柱子根G50的原理差不多吧。
这是过分子筛后的图：分别为过分子筛之前、过分子筛之后收集的不同管的液体（过柱的条件上样量200微升但浓度较高，0.2ml/min，柱体积16-60，洗脱是用50mM tris PH=8，每一毫升收集一管）。最后的那个泳道也有杂带，只是不太清楚，比较弱。如果在样品中加SDS是不是能有助于分离？加的量又应该是多少呢？请高手帮帮忙吧

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作者: jrwyyplt 时间: 2014-6-21 09:59

下面的杂带应该是GST标签的片断，所以和融合蛋白一样具有亲和作用，这个问题对GST蛋白纯化来说确实很麻烦，而且你的融合蛋白和GST蛋白分子量差别不大，性质应该接近
不知道你是上机器还是手工做呢？
不如试试酶切，看看能否得到较纯的单体蛋白

作者: 红茶可乐 时间: 2014-6-21 09:59

当然是机器了，手工做会不会累死？
我的目的蛋白比较小，打兔子免疫效果不好，所以要连上个GST，因此柱上酶切的方法不行啊！
不知道在样品中加入TRITION X-100或者SDS（浓度不知加多少啊？）能不能分开啊？还有干脆不分了，直接切胶后免疫兔子行不行啊？谁有经验啊？给指点一下吧！

作者: hot_hot_hot 时间: 2014-6-21 10:05

加入triton x-100的量大概是0.1％，或者tween 0.5％左右
可在bingding buffer和样品中加入，甚至在裂解细菌的时候就可以加入。去垢剂有降低杂蛋白吸附的作用，但一般也会减少目标蛋白的结合。不过你的杂蛋白是gst的片断，是否有效果只有做了才知道。
直接切胶回收是可以的，但要求你的胶孔足够大，才能保证含量，所以需要用大板胶来跑。
总之，我觉得GST亲和并不是那么简单，要看运气了，最麻烦的就是表达终止。

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