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标题: 【求助】2D严重的横条纹 [打印本页]

作者: 静夜思 时间: 2014-6-21 10:22 标题: 【求助】2D严重的横条纹

菌体样品处理: 1.液氮研磨成粉状; 2.于7M Urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 40mM DTT, 0.5%IPG buffer涡旋1h; 3.离心取上清; 4.加入4倍体积的ice-cold acetone(40mM DTT), -20C过夜,并用ice-cold acetone洗两次; 5于7M Urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 40mM DTT, 0.5%IPG buffer涡旋1h; 6 Broad法蛋白定量.
上样量为300ug,18cm 3-10AMSHAM胶条,70kvh
蛋白集中于酸性端而没有分开,请各位高手指教?

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作者: orangecake 时间: 2014-6-21 10:23

做过菌体的双向。首先，裂解液悬浮菌体，超声破碎，一定要控制功率，一般是超3妙，停5妙，超声作用时间累计3分钟，然后直接4度过夜就好（也就是裂解液作用要超过8小时），之后12000rpm 30mins离心取上清（twice）。上清液就可以直接跑2D了。其次，没用丙酮沉淀，那东西过一次损失太大了。关于横纹，如果胶条提前泡胀的话建议加30v的低电压，能很好的提高聚焦效果，还能进一步去离子呢（俺们反复试过的）。还有就是平衡时的碘乙酰氨要清楚干净，据说它也能引起横纹。我一般是用超纯水过一遍胶条在吸干。

作者: 周伯通pp 时间: 2014-6-21 10:23

不知楼主的实验参数如何?
你的裂解液和去污剂以及浓度应该问题不大,也许产生横条纹的原因有几种:
1.胶条溶胀30v 至少6小时以上,最好过夜,胶条厚度要达到0.5mm
2.聚焦时间要合适,聚焦时间太短,容易引起大分子蛋白产生横纹
3.第一向时DTT量要足够,否则蛋白二级结构可能打不开.DTT过多主要引起垂直条纹.
4.样品中可能有不溶性蛋白,尤其丙酮沉淀后,可通过高速离心除去.

作者: 静夜思 时间: 2014-6-21 10:24

我将ice-cold acetone沉淀换为“AMSHAM 2-d clean-up kit”后，发现点变得很少了，且基本集中于酸性端，若显色过一点后，也能看到水平条纹。另外发现胶条染色后碱性端有没转上去的，不知何故？

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=25156

作者: baidukk 时间: 2014-6-21 10:24

看你的上样量300ug，做银染好象大了点。如果定量没错的话，一般上样120ug左右就可以。
我觉得是上样量过大，导致一向聚焦不好，而且图象显色时间过长。
正常18cm 胶条可以上到80000vhs，

作者: baidukk 时间: 2014-6-21 10:25

后面的图估计是样品处理的问题，导致蛋白丢失，碱性端没转上去可能是一向转二向时操作的问题。我没做过菌体蛋白的双向，具体的还要学习一下。共勉！

作者: zzzz 时间: 2014-6-21 10:25

第一张银染是染过了，考虑换一下4-7的胶条吧。我也做菌体的，也和你一样，出现横条纹，尤其是酸端，有什么经验阿，互相学习一下。图在我的帖子里，不过是用考染的。横纹我还没有解决呢。
我和你的做法差不多，液氮研磨，TCA/丙酮沉淀，看你的图，是不溶物太多了吗

作者: 静夜思 时间: 2014-6-21 10:26

我正在做4-7的,可是我发现我的点还是太少了,不太正常啊

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