标题:
【求助】WB转膜转不上
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作者:
zranqi_1
时间:
2014-6-21 10:27
标题:
【求助】WB转膜转不上
我做细胞的WB,分子量分别是40和80的,胶都跑得不错,可就是转膜转不上。我用的是半干法,转移缓冲液的配方是:48mmol/L Tris,39mmol/L甘氨酸,0.037% SDS,20%甲醇。开始用10%的胶,转80mA稳流,60min,第一次转得还行,可以后怎么都转不出来了,转过膜的胶染色后还有很多残留;后来变为8%的胶,按膜面积计算的电流(0.8mA/cm2),转了60min,头一两次转得还行,用立春红染色还算明显,但后来却怎么都转不出来了。用的还是同样的试剂,同样的蛋白样品,怎么就重复不出来呐?请教各位高手,究竟是怎么回事?
作者:
3N4G
时间:
2014-6-21 10:28
电极有没有断路,或仪器出现了什么问题?
作者:
greenbee
时间:
2014-6-21 10:29
用的是同一批膜吗
作者:
ero11
时间:
2014-6-21 10:29
1)如果你用的是国产的膜,要注意正反面,一般是光面的为正面,要将正面对着胶;
2)分子量为40和80用10%的胶应该是没有问题的
3)你的正负极有没有弄反?
4)膜的大小应该超过滤纸,否则易短路
5)你的转移缓冲液有无配错?次数不能用太多,一般最多3,4次
6)可放冰了?
7)可加长转的时间.用一个半小时看看
作者:
join
时间:
2014-6-21 10:29
胶与膜之间不要存在气泡,这是转膜的最起码要求
作者:
applebook=213
时间:
2014-6-21 10:30
Is there a special reason that you have SDS in the transfer buffer? I have never seen a reciepe like this. I think this is the problem!
Good luck
作者:
vvmmoy
时间:
2014-6-21 10:30
做“三明治”时膜胶之间有起泡的话,气泡在胶-膜之间引起的绝缘区使蛋白无法通过而不能到达膜上,这一步在操作时尤其要小心,我自己犯过,也看到其他人犯过。我的办法是把胶铺到膜上,先使其一边接触膜的一边,这样就会在胶和膜交界的地方形成一个水相前缘,然后慢慢落下凝胶,这样这个水相前缘就会逐渐推进直至胶膜重合,如是则不会有气泡产生。把胶铺到膜上而非相反是因为胶是透明的,可以看到水相前缘以及有无气泡产生。
作者:
68943512yao
时间:
2014-6-21 10:30
既然以前能转成功,我想楼主的操作不会有太大的问题.我觉得飞翔的理由分析的很对,你可以再试试.我们的转移buffer一般只用一次,还有就是转移的膜要小心的存放,注意正反.希望对你能有帮助
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