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标题: 【求助】原核表达的怪事 [打印本页]

作者: lgm 时间: 2014-6-21 10:42 标题: 【求助】原核表达的怪事

我有一个原核表达菌，原来表达过2次，特异条带很浓，但是后来就怎么也表达不出来了。质粒去测序是对的，也重新转过新的表达菌。每次表达也做了阳性对照，阳性对照均能诱导。不知道各位站友有没有遇到过类似的情况？

作者: bring 时间: 2014-6-21 10:43

这不是怪事

作者: plaa 时间: 2014-6-21 10:44

转自 cuturl('http://drugfocus.net/viewthread.php?tid=2361&extra=page%3D7')
我们在利用质粒进行表达目的蛋白的时候,是否遇到这样的情况:以前表达的菌株现在不表达了,是什么原因引起的?
估计原因也很难说清,我在看一本书时,发现有一段讲的挺好,就给翻译过来了.如果大家觉得有问题,我们可以进行讨论
质粒是一种游离于染色体外的、位于细胞浆中、能自我复制的DNA组件，可存在于原核和真核细胞中，常被用于重组基因表达的分子载体。由于其操作简单，当利用原核细胞作为宿主时，质粒表达系统最为常用.质粒的拷贝数由质粒，宿主和培养条件共同决定，一般情况下，主要由拷贝数控制基因决定，拷贝数多的能达到200.
质粒的存在加重了宿主的负担，因为宿主的资源被用于质粒的复制和质粒编码基因以及目的蛋白的表达，当插入基因长度越大，温度越高，表达水平和目的蛋白的产量越高以及目的蛋白对宿主的毒性越大时，宿主的代谢压力越大。这种代谢压力常常导致含有质粒的宿主细胞生长速度降低，同时拷贝数越多，压力越大，因此，随着有质粒的细胞生长缓慢而无质粒的细胞生长不受影响，最终导致培养中含有大量无质粒的宿主。质粒的丢失是目的蛋白产量降低或者不表达的主要原因.
无质粒细胞如何产生?细胞分裂过程中，质粒的不平均分配导致了无质粒细胞的产生，称为质粒分离不稳定性，子细胞中质粒的拷贝数取决于母细胞质粒拷贝数和分裂时的随机分布。如果母细胞中质粒拷贝数高（大于10），无质粒子细胞出现的可能性就非常低。另一个加速无质粒细胞形成的因素是质粒的多聚化，由于质粒含有相同的基因序列，他们可以重组形成一个环，含有2个复制子，这种多聚体导致分列到子细胞中的质粒更少，增加了质粒丢失的可能性，另外，含有质粒多聚体的细胞即便拷贝数一致，其生长慢于质粒单体的细胞。其他影响质粒稳定性的因素由质粒大小，是否存在外源DNA，细胞生长速度，营养丰富程度，温度，培养的方式，这些将在以后逐一讨论。
质粒的结构不稳定性是目的基因表达丢失的另一重要原因。质粒的基因结构重组，形成一个不表达的质粒，这种现象少于分配不均一性造成的不稳定现象，且不能通过选择压力来预防，相反，在外源基因的表达时存在***度的阳性选择压力能够诱导结构不稳定性，结构不稳定性可以导致目的但白不表达或者产生无用蛋白（氨基酸序列上存在小的变华，如缺失，插入，替代），后一种现象危害更大，因为它的出现没有任何表现，选择标记没有改变，不易察觉，必须要进行测序才能发现。
再者，在质粒为基础的表达系统中，一个重要的方面是质粒的拷贝数，尽管，高拷贝一般会提高重组蛋白的产量，但这也不是每次都正确。例如，高拷贝能提高蛋白表达的速度，形成蛋白聚集，缺少正确的翻译后修饰，高拷贝的质粒也可能导致目的蛋白产量很低，可能是翻译效率低造成的，因此，不同的表达应选择不同的表达册列，像用于基因治疗的DNA产品，我们首选高拷贝.

作者: lgm 时间: 2014-6-21 10:45

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谢谢天边一朵云的资料。但是有什么解决方法么？我这个做得很头痛啊，又急着毕业，多谢多谢！

作者: jujuba 时间: 2014-6-21 10:45

楼上的解释理由似乎不是很充分哦，要是出现质粒不稳定，丢失，突变，那楼主不是测序正确了吗，而且新转化了表达菌了也不能表达。
我觉得光从楼主的描述的现象去理解，似乎不太好分析问题所在，楼主应该描述的更详细些，比如所用的表达载体和表达菌主的名字，特异条带分析时电泳的条件，是电泳的全菌蛋白，还是破碎细胞后的上清？沉淀？还有，有没有排除过试剂出现问题的可能性？等等。

作者: lgm 时间: 2014-6-21 10:46

我用得是一个通过PET24改造过得载体pTO-T7,表达菌株用的是BL21。表达一个14kD左右得蛋白。用15%的SDS－聚丙烯酰胺胶跑，考蓝染色。我每次表达均用一个阳性对照，一样的载体，只是联入片断不同，表达一个20kD的蛋白。每次阳性均能诱导，所以基本排除试剂的问题。
怪就怪在，以前能诱导出来两次，但是后来诱导不出来。郁闷啊

作者: nut6694 时间: 2014-6-21 10:46

你能确认以前诱导出来2次的蛋白就是目的蛋白吗？是仅凭电泳条带来判断的？

作者: lgm 时间: 2014-6-21 10:46

对，及其特异啊，表达量占总蛋白的40％

作者: remenb 时间: 2014-6-21 10:47

我也碰到过这种事情，我的办法是用原始质粒从新转化，多挑几个克隆。分别诱导表达。
还有，可能是有时候表达量低，你直接看不到差别，做WB检测一下。
还有你的每次诱导条件是否一致，你也要检查一下你的实验记录。
就知道这莫多，希望有帮助。

作者: bamboo16 时间: 2014-6-21 10:48

这种现象发生的原因只能在表达载体上去进行分析，表达载体上某一部件发生突变。既然楼主有了阳性对照那么，楼主是否利用阳性对照上除外源基因外的载体部分进行克隆构建呢？

作者: 莲花白 时间: 2014-6-21 10:48

有可能是你的电泳胶不能有效地分离你的目的条带，因为14KD已经接近SDS－聚丙烯酰胺胶的分离下限了，建议你可以用tricine胶来试一下，上层4％，中层10％，下层16.5％分离14KD效果绝对比SDS-PAGE好很多。

作者: xueyouzhang 时间: 2014-6-21 10:49

我想应该从几个方面考虑:
1 你表达的这个蛋白有没有特殊性质,如毒性或蛋白酶活性等?
2 你用的质粒载体表达元件有没有问题，譬如说自主复制序列和启动子区有没有突变?
3 你转质粒后的工程菌株做过什么验证?平板抗性筛选后有没有菌落PCR验证? 有没有质粒丢失现象?如果光有平板抗性筛选,建议涂感受态做对照.
4 更换表达载体和感受态再做一次。

作者: lgm 时间: 2014-6-21 10:49

谢谢，我用的使15％的胶啊。还有那些问题我也有考虑啊。最近在重复。

作者: NBA 时间: 2014-6-21 10:50

有可能是你的电泳胶不能有效地分离你的目的条带，因为14KD已经接近SDS－聚丙烯酰胺胶的分离下限了，建议你可以用tricine胶来试一下，上层4％，中层10％，下层16.5％分离14KD效果绝对比SDS-PAGE好很多。

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这种三层的胶是直接用上述的浓度来配吗？能不能发一张电泳效果图上来看看呀

作者: lgm 时间: 2014-6-21 10:50

对啊,我也想看看.还有其中的配胶缓冲液是用什么呢?

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