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标题: 【求助】帮我看下胶，谢谢 [打印本页]

作者: ffaa 时间: 2014-6-21 17:02 标题: 【求助】帮我看下胶，谢谢

酸性端大分子量区域的蛋白点比较集中没有分开，不知道是什么原因，
17cm胶条聚焦10000V，60000vhour, 问下各位大侠是不是聚焦不够呢？因为横条纹较多，感觉没有分开

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作者: bring 时间: 2014-6-21 17:02

不知你是什么样品，我一般是70000vh，你可以试试

作者: ffaa 时间: 2014-6-21 17:03

谢谢，看来可能是聚焦不够造成横纹较多，我用的是BIO-RAD的聚焦仪，样品是细胞蛋白

作者: 子衿青青 时间: 2014-6-21 17:03

我觉得图上垂直条纹也比较明显，可能的原因是蛋白质中含有较多的核酸，它们增加样品的粘性并造成背景拖迹，甚至封闭胶孔，应该使用Dnase I and RNAse A酶降解它们；核苷酸，磷脂，代谢物等内源性的小离子杂质常造成胶条阳性端等电聚焦不理想，应该用ＴＣＡ／丙酮法，透析等方法去除它们后上样．另外，在酸性端大分子区的确蛋白质没有很好的分开，我觉得可以采用窄范围ＰＨ胶条（如４－７范围）且减小胶浓度，让这个区域的蛋白质得到好的分离．

作者: wsll 时间: 2014-6-21 17:03

你的样品没有问题吗？
就是你处理样品的过程你确认是很优化的话，你可以摸索下聚焦的时间和电压乘积的影响，不过我建议你现在最好把样品的影响因素先排除才能做结论是聚焦的的原因！
假如前面的没问题的话，你可以考察下聚焦的影响因素！
祝你好运！

作者: ffaa 时间: 2014-6-21 17:04

我也感觉我的样品处理有些问题。我使用的是BIO-RAD 的全蛋白提取试剂盒。细胞培养在60mm板中，用冷的PBS洗后再用水洗一遍，然后加入400ul提取液（7M尿素，2M硫脲，1％ASB-14去污剂，40mM Tris 碱，0.001%嗅芬蓝，1％TBP）,加完后的溶液确实很粘稠，有点象软软的鼻涕状，跟核酸溶解的样子很象。
但是楼上所说的Dnase I and RNAse A酶，我担心这是人为的在样品中加入蛋白质，增加样品的复杂性，这样可行吗？
ＴＣＡ／丙酮法，透析等方法，虽然增加了样品提取时的步骤，使得批次之间的变异程度提高，但是这是针对核酸类物质的好方法，楼上可以提供个这个方法的链接吗？

作者: bring 时间: 2014-6-21 17:04

我考虑后觉得你说的对，加入那些酶的确是人为加入了蛋白质，增加了样品的复杂度．我通过查资料，跟别人讨论，得出的结论是：你是细胞样品的话，可以通过离心去除核酸．另外，TCA/丙酮法（我所在的实验室）现在已经改进成直接用丙酮沉淀，即加－２０度的冰丙酮（４－５倍过量于样品）到样品，－２０度沉淀２－３小时即可．然后离心，再将上清吸出，用氮气将沉淀吹干或冷冻离心机冻干（冷冻时间不宜过长，以免样品再次溶解困难）

作者: memory 时间: 2014-6-21 17:05

我看了一下楼上的，沉淀方法里面说冷冻离心机冻干具体是怎么操作的？有没有TCA/丙酮法的具体方法呢？谢谢，另外我也把我的胶贴上来大家给分析分析吧！

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作者: 喵咪 时间: 2014-6-21 17:05

为什么不用TCA/丙酮沉淀蛋白质呢？两者的连用不是效果更好么？

作者: orangecake 时间: 2014-6-21 17:05

据报道用TCA/丙酮的方法会造成蛋白重悬困难。

作者: orangecake 时间: 2014-6-21 17:06

你说你们离心直接出去核酸，能告诉一下具体的操作吗？是加完裂解液作用后再离心？大概多少的转速？还有，我也用的是丙酮沉淀，你们用的丙酮是国产分析纯还是进口的？谢谢！

作者: duoduo 时间: 2014-6-21 17:06

1.楼主的蛋白大都挤在中部，可用4-7线性或3-10的非线性胶条试试
2.聚焦不够

作者: nvdabing 时间: 2014-6-21 17:07

主要由于盐离子浓度过高导致的，可以增大聚焦的伏小时数，并且你样品中盐离子浓度还是很高的即使升压不是问题，同时核酸是导致酸端现象的重要原因，采用离心可将其除去大概高于40000g，碱端由于电内渗造成的，也是离子浓度高导致的

作者: orangecake 时间: 2014-6-21 17:07

你说你们离心直接出去核酸，能告诉一下具体的操作吗？是加完裂解液作用后再离心？大概多少的转速？还有，我也用的是丙酮沉淀，你们用的丙酮是国产分析纯还是进口的？谢谢！

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