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标题: 【求助】蛋白脱盐浓缩的好办法 [打印本页]

作者: 天蝎座 时间: 2014-6-21 17:37 标题: 【求助】蛋白脱盐浓缩的好办法

我的蛋白过了肝素的柱子后盐的浓度很高，我想脱盐又不伤害蛋白的活性，有什么好办法啊，那位请指点一下，我用过Amicon（10kD）超滤杯反复洗两次后几乎检测不到蛋白，损失特别的大，另外想先用HI-TRAP的脱盐小柱或透析先脱盐再浓缩，这样分步做损失可能会小一点，有没有那位有更好的建议啊，急死我了，SOS

作者: 49888 时间: 2014-6-21 17:37

凝胶柱除盐效果就不错，收率高，但是会稀释样品．

作者: wawa 时间: 2014-6-21 17:38

低温透析
处理量还大

作者: 天蝎座 时间: 2014-6-21 17:38

感谢两位,但是这都只能除盐,却不能浓缩啊

作者: vivian4123 时间: 2014-6-21 17:38

又脱盐又浓缩就是合适大小的超滤膜了吧

作者: fsdd817 时间: 2014-6-21 17:39

又脱盐又浓缩就是合适大小的超滤膜了!
这个确实是,但是超滤膜一般都会吸附很多蛋白,30-40%都可以算正常值.你不想损失那么多，只能多用水洗膜,这样还是达不到理想的浓缩效果吧!
建议:浓缩用透析袋包埋PEG的办法,脱盐要看你蛋白特性了,盐浓度大还是选择过脱盐柱比较好,透析透干净需要的时间比较长!

作者: flower-201 时间: 2014-6-21 17:39

蛋白吸附没有那么大的
选择亲水滤膜，蛋白浓度不要太低，正常收率应该在95%以上。

作者: fsdd817 时间: 2014-6-21 17:40

我说的一点都没夸张，吸附的多少应该和蛋白的不同有关。

作者: 66小飞侠 时间: 2014-6-21 17:40

用丙酮等有机溶剂浓缩试试，这样即可以浓缩，还可以脱盐。
但是活性会损失一些，而且脱盐可能也没有那么的彻底。

作者: vivian4123 时间: 2014-6-21 17:41

超滤吸附除了看蛋白的性质，还要看膜的选择。
蛋白吸附30~40%只能说明工艺条件没有优化好，绝对不是正常现象！

作者: am10 时间: 2014-6-21 17:41

超滤收率低的几个原因：
蛋白浓度低，吸附严重；或膜亲水性差
孔径不合适，导致蛋白损失在透过液；
buffer条件不合适，盐浓度/pH使蛋白沉淀；
过度浓缩，膜表面浓度过高导致失活沉淀；
流速过快，泡沫严重

作者: jkobn 时间: 2014-6-21 17:41

我想问一下,peg包埋会不会对蛋白活性和结构有影响？我一直用冷冻干燥浓缩，很慢。磷酸缓冲液中的磷酸钠属于蛋白质中的盐吗？

作者: am10 时间: 2014-6-21 17:42

如果是用的磷酸缓冲液洗下来的蛋白，我建议还是选择用脱盐柱脱盐,从我们的实际情况来看,透析时间都比较长!

作者: BOSS2011 时间: 2014-6-21 17:42

用透析袋透析除盐，完成后将透析袋埋在PEG中，进行浓缩

作者: 天蝎座 时间: 2014-6-21 17:43

我想问一下,peg包埋会不会对蛋白活性和结构有影响？我一直用冷冻干燥浓缩，很慢。磷酸缓冲液中的磷酸钠属于蛋白质中的盐吗？

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你想问的问题我也想问啊,但是磷酸钠肯定是属于蛋白质中的盐,PEG包埋的损失好象也很大,透析膜也会吸附许多的蛋白,而且一定要选择合适分子量的PEG不然PEG会漏进去;
你一直用的冷冻干燥我也想用,但是担心对蛋白的活性有影响,请问:你有在冷冻干燥前加保护剂吗,比如甘露醇什么的;你是把蛋白冻成干粉再溶解(这样会不会因为蛋白的盐浓度太高而不容易溶解啊),还是留有部分液体以浓缩液的形式保存啊(这样又有冻融的危险哦),我在可真是前怕狼后怕虎啊,呵呵

作者: 天蝎座 时间: 2014-6-21 17:44

超滤收率低的几个原因：
蛋白浓度低，吸附严重；或膜亲水性差
孔径不合适，导致蛋白损失在透过液；
buffer条件不合适，盐浓度/pH使蛋白沉淀；
过度浓缩，膜表面浓度过高导致失活沉淀；
流速过快，泡沫严重
......

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那不就是浓度高了也不行,低了也不行啊,我这是总蛋白,后面要做DNA结合实验的,所以很担心蛋白失活,我选择的膜孔径是截留为10KD的,离心速度在PROTOCOL上有固定值啊,这个快慢又如何去确定呢,能不能推荐哪个公司的产品亲水性比较好,我用的是是MILLIPORE的,但是觉得效果不大好哦

作者: 天蝎座 时间: 2014-6-21 17:44

感谢各位杂这里献技献策,但是我还有一个比较笨的问题想问,不同的蛋白的溶解度应该不同,那我们这个浓缩究竟有个什么样的浓度底线才能使总蛋白中的有尽量多的蛋白啊

作者: bamboo16 时间: 2014-6-21 17:45

如果蛋白浓度低,就先取大量样品冻干;然后少量Buffer溶解后透析/或上除盐柱?

作者: redbutterfly 时间: 2014-6-21 17:45

我想问一下,peg包埋会不会对蛋白活性和结构有影响？我一直用冷冻干燥浓缩，很慢。磷酸缓冲液中的磷酸钠属于蛋白质中的盐吗？
你想问的问题我也想问啊,但是磷酸钠肯定是属于蛋白质中的盐,PEG包埋的损失好象也很大,透析膜也会吸附许多的蛋白,而且一定要选择合适分子量的PEG不然PEG会漏进去;
你一直用的冷冻干燥我也想用,但是担心对蛋白的活性有影响,请问:你有在冷冻干燥前加保护剂吗,比如甘露醇什么的;你是把蛋白冻成干粉再溶解(这样会不会因为蛋白的盐浓度太高而不容易溶解啊),还是留有部分液体以浓缩液的形式保存啊(这样又有冻融的危险哦),我在可真是前怕狼后怕虎啊,呵呵
我冷冻干燥前没有加保护剂，分子量不是很大的话冷冻干燥不会有太大的影响，分子大的话可能会改变他的空间构象（听老师说的）。我的蛋白分子量大约40多kd.活性还好没丢。不过我发现，如果冻成干粉再用buffer溶的话，在做page的时候，蛋白跑不动，这是我正愁的问题！而我没冻干留有少量的液体时，做page不错。我不知道为什么跑不动连溴芬兰都不跑！郁闷呢！是不是盐的问题？大家帮我想想阿！谢谢！

作者: redbutterfly 时间: 2014-6-21 17:46

还有请问你说得合适分子量的peg 是什么意思啊？我不太懂，我没用过。谢谢！

作者: 天蝎座 时间: 2014-6-21 17:46

PEG有很多种啊,因为它是一种聚合体,所以分子量有高的如PEG20000也有底的PEG2000不等啊,如果你的透析袋孔径太大,不就漏进去了吗
page跑不动很可能就是盐的问题,盐会中和SDS的负电荷,自然就跑不动了,也有可能是胶和buffer 的问题
对了,你的蛋白冷冻干燥后溶解了,怎么保存的啊,你是分成一管管的小份,分别溶解.不用的就直接保存了，还是加了保护剂如甘油什么的放-80度保存啊,怎么才能不损失活性呢,呵呵

作者: yychen 时间: 2014-6-21 17:46

我是直接用buffer溶解后不用的冷冻，没有用什么保护剂。我认为应该看你的蛋白分子量大小了，是否怕冻！
那是不是选择peg的时候分子量大点应该好些吧！呵呵，谢谢！

作者: 33号 时间: 2014-6-21 17:47

我认为低温超滤可行，正如前面几位所述，选择好膜很关键。其次避免损失，可以先浓缩大一些，后用适宜的缓冲液洗膜，并入浓缩液中。

作者: leifengta 时间: 2014-6-21 17:47

冷冻干燥最好。

作者: 天蝎座 时间: 2014-6-21 17:47

是啊,我认为是这样的

作者: is2011 时间: 2014-6-21 17:48

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超滤膜号称回收效率95％，是分蛋白性质的。我刚用的结果蛋白损失接近一半，效果比较差，个人认为单纯浓缩的话，冷冻干燥是最佳选择。分成小管，不加保护剂，保存于－20，用的时候合适体积缓冲液溶解即可。脱盐的话我都是用合适的透析膜低温透析，一般换液4－5次就可达到试验的要求。如果快速的透析膜浓缩的话，可以用合适的peg包埋脱水的，不过我自己没用过。我想如果既要脱盐又要浓缩，先透析，后冻干我个人还是很偏好的。不是很赞成超滤膜，因为造价高，效果也不好

作者: birdfish 时间: 2014-6-21 17:48

也不能叫号称了
过程的设计和优化是门大学问。
主要看用途和规模，如果是实验室小量制备，透析就可以满足要求；如果是规模化生产，超滤是免不了的。
超滤可以buffer exchange，冻干除不掉盐的。

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