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标题: 【求助】有人做过聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳吗？ [打印本页]

作者: popo520 时间: 2014-6-21 17:58 标题: 【求助】有人做过聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳吗？

我想做这个实验，问了一下别人说这个电泳和SDS差不多，只是需要梯度混合仪，但是我看文献上说得试剂都配的不一样啊？有人有具体的操作方法吗？告诉我好吗？
文献上要配的试剂如下：
聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量（Mr）
试剂和器材：
试剂：
1．  贮液（用于制备梯度胶）
（1）  Tris 10.75g
硼酸 5.04g
EDTA 0.93g(EDTA.2Na.2H2O)
PH8.3
溶于蒸馏水中
定容至1000ml
(2)  丙烯酰胺 57.6g
亚甲基双丙烯酰胺 2.4g
溶于贮液（1）中
定容至100ml后过滤
(3)  丙烯酰胺 7.68g
亚甲基双丙烯酰胺 0.32g
溶于贮液（1）中
定容至100ml
(4)  TEMED 0.3ml
溶于贮液（1）中
定容至100ml
(5)  AP 0.3g
溶于贮液（1）中
定容至100ml
2. 电极缓冲液（0.09mol/L Tris,0.08mol/L 硼酸，0.0025mol/LEDTA(PH8.4)）
10.89g Tris
4.95g 硼酸
0.93g EDTA(EDTA.2Na.2H2O)
加水溶解，定容至1000ml
3.25%乙醇
4.0.1%溴酚蓝指示剂
5．固定液：10％的磺基水杨酸溶液
6．染色液[0.1% 考马斯亮蓝R250，25％甲醇，10％乙酸溶液]
1g考马斯亮蓝R250
溶于250ml 甲醇
加入100ml 冰乙酸
用水定容至1000ml
7. 脱色液[25％甲醇，10％乙酸]：
250ml 甲醇
100ml 冰乙酸
用水定容至1000ml
8．7％乙酸

作者: am10 时间: 2014-6-21 17:58

我做过梯度胶，配方和普通的SDS－PAGE一样，这是配两个不同浓度的分离胶，如果你的梯度是4－20％，那么你就配4％和20％的分离胶，然后胶配好的分离胶到如梯度混合漕中，注意大浓度的在前面，然后然后打开仪器，20％的先流出，再就是低于20％（4％与20％混合的）的了，最后是4％的，这样就是梯度胶了。和梯度洗脱的原理差不多！

作者: popo520 时间: 2014-6-21 17:59

那就是不用上面我所说的这么麻烦喽，谢谢你啊，那电极缓冲液也是跑SDS的那个吗，但那个不是得加SDS吗？对了，SDS分离胶也要加10%SDS,做梯度胶的时候应该不用加吧？谢谢

作者: am10 时间: 2014-6-21 17:59

电极缓冲液以及分离胶的配方和普通的SDS－PAGE是一样的

作者: bling 时间: 2014-6-21 18:00

电极缓冲液以及分离胶的配方和普通的SDS－PAGE是一样的

作者: popo520 时间: 2014-6-21 18:00

我还没开始做呢，我们实验室没有，我还要到别人的实验室做，我不知道他们的是多大的，不能解决你的问题了，呵呵

作者: 6327555 时间: 2014-6-21 18:00

做的时候很不好把握，特别是要使梯度很完整就要求很熟练，而且胶的凝聚速度不能过快

作者: DONT 时间: 2014-6-21 18:01

能帮我打听下，他们是哪里买的吗？
我想自己买一个，但是网上没找到
哪个厂有，给我个联系方式就行，我自己去联系
先谢谢了
祝你实验顺利

作者: popo520 时间: 2014-6-21 18:01

我今天下午做过了，他们的那个梯度混合器很小啊，估计就是二十ml左右，不过我没想到要问一下是哪里买的，呵呵，他们明天出差，只好等他们回来再问了，呵呵

作者: vera+ 时间: 2014-6-21 18:01

我以前做小胶时(Bio-Rad的Mini槽) 用手混梯度, 效果也不错啊, 不用梯度仪. 不过要是胶量大就不行了

作者: yonger 时间: 2014-6-21 18:02

我也是做小胶，分离胶6ml的。
手混梯度具体是怎么做的，介绍下吧

作者: 04906 时间: 2014-6-21 18:02

购买梯度胶混合仪，３０ｍｌ最小的了，北京六一仪器厂，１２０元，我买过．
请问lirui1229 ，你的那个用的怎样？
手动制备梯度自然没有梯度混合仪的好，我也做过阶梯状梯度胶，跑胶时影响效果，不如连续梯度好．

作者: popo520 时间: 2014-6-21 18:03

我用的那个挺好用的，并且他们实验室一直有人用，都说用的挺好的，就是我的胶跑完了有竖条纹，不知道是什么原因

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