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标题: 【求助】我的western结果为什么总是出现哑铃状条带？ [打印本页]

作者: chenshuanhe 时间: 2014-6-21 21:55 标题: 【求助】我的western结果为什么总是出现哑铃状条带？

我作的蛋白比较大，220kd，100v，我跑胶3－4小时，切胶，200ma湿转3.5小时，脱脂奶封闭1.5小时，二抗3小时，结果条带的两头总是有两个比较重的黑色，而中间确不是很清楚，不知道为什么？哪位作western的高手给点指点吧。谢谢了！

作者: mamamiya 时间: 2014-6-21 21:55

你是在杂交盒里做的吗？

作者: mamamiya 时间: 2014-6-21 22:24

你是在miniblotter里做的吗?

作者: mamamiya 时间: 2014-6-21 22:25

你每个泳道的蛋白上样量是多少？

作者: eve_49 时间: 2014-6-21 22:28

上样量100ug蛋白，是在小平皿里面摇一抗4度过夜的，在给点指点吧，谢谢各位了！

作者: leifengta 时间: 2014-6-21 22:30

您的一抗稀释比和二抗稀释比是多少？重新调整一下稀释比例
转膜时，你的膜最后一定很热吧，若由此情况，一定要考虑降温的，建议您用4度转过夜，先28V转1小时，然后再84V转印14－－－16小时。（主要是这点）有问题可以打我电话，021---64368276（晚上打给我8点后）

作者: leifengta 时间: 2014-6-21 22:31

很大程度是转膜不均允造成的，需要转时间长一些

作者: chenshuanhe 时间: 2014-6-21 22:32

我试试看，如果有改善就不打你电话了，如果不行，可免不了麻烦你呢！再次感谢！我一抗稀释浓度为1：2500，二抗也是1：2500，我转膜的时候，时在4度转的，膜转完之后的温度我倒是没有注意，应该也不是很高，我前面几次作都没有出现这样的问题呀，不知道是为什么，是不是上样量太高了呢？百思不得其解呀

作者: chenshuanhe 时间: 2014-6-21 22:32

跑胶电压，我原来用150v都没有问题呀，现在用100v慢慢来反而不行了，真是郁闷

作者: hold住 时间: 2014-6-21 22:33

是否膜切成条了？
是否切的太细？

作者: milkdog 时间: 2014-6-21 22:34

是不是上样量较大的原因呢，我们做western的时候上样通常控制在总蛋白
50ug,这样跑出的条带比较漂亮，现在你的上样量为100ug,个人认为上样量较大。
转膜如果用100v湿转的话，2h应该可以了。
还有跑胶电压是否可以调的大一些？我们跑分离胶时，通常用到140、160v。
建议从以上几个条件试试，祝好运.

作者: jiushikeshui371 时间: 2014-6-21 22:35

是不是上样量较大的原因呢，我们做western的时候上样通常控制在总蛋白
50ug,这样跑出的条带比较漂亮，现在你的上样量为100ug,个人认为上样量较大。

如你所言,mini胶100ug对于中低分子量蛋白来说是到极限了,50ug正好,但要考虑到目的蛋白220kd,是个很大的数字,很难转膜完全,有时为了提高检测的阳性率尚需特意提高上样量至极限,而且要加大转膜的力度.实际上分子量大了以后很容易出现哑铃状,主要原因是转膜不充分造成的,因为考染时可明确显示条带的分布多数是正常的.这么大的分子量,转膜力度大了也不会穿膜,倒是要提防不充分这个常见原因,考染转膜后的胶可确认.

作者: chenshuanhe 时间: 2014-6-21 22:36

谢谢诸位，我也会比较偏向转膜力度不够这个原因，200ma转3.5都不够，我想要不我还是转过夜算了，第二天在加大电压，200ma再转2小时，我觉得这样应该差不多了吧，各位还有什么高见么？多提点意见喔！

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