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标题: 【求助】分子筛如果提高分离效率 [打印本页]

作者: vvmmoy 时间: 2014-6-25 18:07 标题: 【求助】分子筛如果提高分离效率

我们实验室用的是pharmacia 的 sephadex G50 medium自己装的50cm长的柱子，我现在用它来分GST（26KD）与切下来的目的蛋白（12KD），发现分离的效果很差。实验室其他人分GST（26KD）和5KD的蛋白虽然能获得较纯的目的蛋白，但是会有较多的损失（目的蛋白有GST污染）。流动相我们用过水，PBS，Tris，感觉没什么大的差别。流速从1ml/min 到0.25ml/min都试过，也没有明显改善。没有经验，真是不知道该怎么优化分离条件，还是这个填料就是很难把26KD和12KD的分开？请教高手指点一二！急呀！

作者: PINK 时间: 2014-6-25 18:07

柱效有多少？上样体积多少？流速对分子筛的影响比上样体积要小得多。

作者: remenb 时间: 2014-6-25 18:07

加长柱子到80或100cm,还超细填料,或者换刚性好颗粒细的34um的填料.

作者: 33号 时间: 2014-6-25 18:08

分子量差别不大，还是试一下离子柱，我以前做过用SuperdexG-75分34kDa和15KDa的蛋白也没有获得成功。如果杂蛋白不多的话，我建议您考虑使用Sepharose HP或 Source Q 30.，估计问题不大。

作者: JK.jon 时间: 2014-6-25 18:10

现在的问题就是不能换柱子。我们老板过日子很仔细滴。愁啊

作者: fei1226com 时间: 2014-6-25 18:10

降低流速
增加床高
选用高效填料
减少样品体积

作者: mamamiya 时间: 2014-6-25 18:10

建议将FPLC,该为用HPLC.

作者: xyw5 时间: 2014-6-25 18:11

可是你们老板太抠不能换柱那就没什么办法了. 本来G50分这两个蛋白也就不是容易的事

作者: bling 时间: 2014-6-25 18:11

换好的填料，我用过SuperdexG-75（超细的），装柱子的时候要控制流速，我的柱子柱效是9000多，不过不知道准不准，分离效果还可以，但不知道可不可以分得开，还有上样量不能太大，1.6*50cm的柱子我一般只上1ml，2.6*70的我一般上5ml.

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