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标题: 【求助】蛋白电泳的问题 [打印本页]

作者: DONT 时间: 2014-6-26 17:00 标题: 【求助】蛋白电泳的问题

我的蛋白电泳时，分离胶12%浓缩胶4……都一个快小时了怎么还没有出加样孔？

作者: mamamiya 时间: 2014-6-26 17:00

没出加样孔实际上就是基本没有迁移，最大可能是断路，没有电压加在上面。检查一下电压和电流看是不是正常？看看电泳槽的上槽漏不漏，有没有夹紧漏了以后电极和胶就分离了，当然就没有电压了。再一个，缓冲液有没有加足量？上下槽缓冲液是不是把胶和电极都浸没了？这些原因我都遇过。还一个，整个电路是不是通的？查查以上原因吧，但愿会有阳性发现。

作者: tangxin_80 时间: 2014-6-26 17:01

有可能是你样品的盐浓度太高了，我也曾经碰到过这样的情况，你把你的样品处理一下再上样看看。

作者: mamamiya 时间: 2014-6-26 17:01

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原帖由 tangxin_80 于 2014-6-26 17:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
有可能是你样品的盐浓度太高了，我也曾经碰到过这样的情况，你把你的样品处理一下再上样看看。

向tangxin以及其他知晓的战友求教：
1 什么情况下会导致样品的盐浓度太高？盐浓度多高才会导致？我是裂解组织和细胞总蛋白/胞浆蛋白，用5*上样缓（样本稀释度很低吧，基本等于原液），却从来没有遇到过此情况。
2 样品处理又是什么意思？是透析之类吗？代价比重提蛋白高吗？因为我没做过，看到园子里有好多战友也这么分析原因，所以很想知道。
在这里先谢了。

作者: ritou1985 时间: 2014-6-26 17:01

透析很简单的
选好合适的透析袋，用适当的buffer或者蒸馏水透析就可以了

作者: c86v 时间: 2014-6-26 17:02

透析可以吗？还有不明白为什么盐浓度高也可能出现这种情况
还有就是看看电压是否够了，有没有电流？

作者: ero11 时间: 2014-6-26 17:02

盐浓度高会影响样品的pH值，跑出来的效果也是很差的，条带可能是大大的一坨

作者: mamamiya 时间: 2014-6-26 17:03

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原帖由 ero11 于 2014-6-26 17:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
盐浓度高会影响样品的pH值，跑出来的效果也是很差的，条带可能是大大的一坨

谢谢解答，不过仍有疑问如下
不是有上样缓保证PH吗？而且本来上样缓和浓缩胶的PH6.8与电泳缓冲液的8.3和分离胶的8.8就有别，但因电泳温度变化会上下浮动0.5左右的，而且盐（大家不是特指NaCl的吧？）本身非酸非碱，怎么会影响上样缓的Tris-HCl缓冲对呢？难道是氯离子过高引起？那其他离子（盐）会不会影响呢？望知情者详释

作者: u234 时间: 2014-6-26 17:03

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原帖由 mamamiya 于 2014-6-26 17:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

向tangxin以及其他知晓的战友求教：
1 什么情况下会导致样品的盐浓度太高？盐浓度多高才会导致？我是裂解组织和细胞总蛋白/胞浆蛋白，用5*上样缓（样本稀释度很低吧，基本等于原液），却从来没有遇到过此情况。
2 样品处理又是什么 ...

1、硫酸铵沉淀的蛋白或离子交换洗下来的样品，比如说用1M NaCl洗下来的目的蛋白。我以前把0.2M、0.4M、0.6M、0.8M 、1.0M洗下来的样品直接跑过电泳，结果在浓缩胶和分离胶交界处是很明显的看见从低到高的条带，不含NaCl的样品很快浓缩成一条线了，而1M NaCl样品还是长长的。凭我的经验是超过0.3M NaCl条带就跑得不好了。我一直用0.15M NaCl的样品跑结果也还行。
2、样品处理有透析，也有三氯乙酸或有机溶剂处理上样吧。
另外，我觉得是氯化钠里的钠离子在电泳条件下向负极移动，向上移动，导致高盐样品在电泳中变慢，影响蛋白电泳行为，使跑出来效果很差。

作者: mamamiya 时间: 2014-6-26 17:04

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原帖由 u234 于 2014-6-26 17:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1、硫酸铵沉淀的蛋白或离子交换洗下来的样品，比如说用1M NaCl洗下来的目的蛋白。我以前把0.2M、0.4M、0.6M、0.8M 、1.0M洗下来的样品直接跑过电泳，结果在浓缩胶和分离胶交界处是很明显的看见从低到高的条带，不含NaCl ...

难怪我没有遇到这种情况呢,看来我实验还没做到那么深,只在western的简单水平,裂解液NaCl只有0.15M,浓度不够高啊.哦,这么说以后要做类似实验倒要注意了.
关于第2点我还不知道真伪,就作为一种学说吧

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