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标题: 【求助】帮我看下2D胶 [打印本页]

作者: zhezhe 时间: 2014-6-26 17:09 标题: 【求助】帮我看下2D胶

前两天跑的胶，让自己都大跌眼镜，怎么能跑成这样呢？虚心向同行请教
碱性区域的竖条纹是怎么回事？
中间有段没有蛋白，是不是因为泡胀不均匀所致？如何控制胶条放入的手法，使得胶条可以均匀泡胀？
平衡液我加的是2.5ml每根胶条，10分钟，是不是太少了？因为有看到过平衡不充分会导致横纹增加

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作者: ritou1985 时间: 2014-6-26 17:09

你泡涨的时候，在泡胀托盘泡胀槽的一侧均匀加入上样液，撕开IPG干胶条的保护膜，胶面向下均匀覆盖上样液，尽量勿产生气泡。关于平衡液你的方法确实有问题，我通常都是用5ml的平衡液平衡十五分钟的，平衡不充分的话肯定就会产生条纹的。

作者: zhezhe 时间: 2014-6-26 17:10

我画了2张图，按照你的意思应该是按照右边的示意图上胶条吧？
你还能解释下碱性区域横贯全图的竖条纹吗？
我二相是恒压300V跑的，3个半小时跑完，是不是太快了？

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作者: jujuba 时间: 2014-6-26 17:10

碱性区域横贯全图的竖条纹是核酸。建议你在处理样品的时候用超声波探头对样品进行半小时的超声（样品置于冰上，频率1万~2万赫兹，超声：间隔时间比为1：9），该步骤可打断大部分DNA和RNA，然后高速离心去沉淀。
平衡液确实太少，一般每步用5ml的平衡液平衡15min。
第二向应该稳流而不是恒压，一般为每板胶20mA，跑完需要8-10小时。

作者: zhezhe 时间: 2014-6-26 17:10

核酸是酸性物质，怎么会出现在碱性区域呢？还请楼上战友进一步解释下，^_^。
在BIO-RAD的操作手册上确实有恒压跑胶的说明，还请楼上解释下为什么不能恒压呢？
关于平衡的时间和用量，我也觉得是太少了

作者: moonlight45 时间: 2014-6-26 17:11

我也是使用伯乐系统，恒压200V，6.5小时左右跑完，循环水浴15摄氏度，你的是不是太快了？你碱性区的竖条纹及蛋白空白区域应该是蛋白水化不均匀所致，核酸是应该在酸性端的。你画的图我没看明白，总之是使水化液均匀铺满IPG胶条面就可以，不要产生气泡。
另外平衡液建议使用5 ml，15 min，你的是少了点。

作者: zhezhe 时间: 2014-6-26 17:11

我画的图是我上胶条的一个具体手法，底部为泡胀槽，上面为胶条。
我采取的是左边的方式，感觉这样上胶条容易挤压胶下的水化上样缓冲液，使得缓冲液在胶下分布不均匀。
右图是我理解的2楼战友的意思，先把缓冲液加在槽内的一侧，然后夹住胶条两端，使胶条平铺在缓冲液上。我觉得应该采取这种方式。
还请各位战友讨论，谢谢

作者: orangecake 时间: 2014-6-26 17:11

楼主：
我也出现了同样的情况，即中间没有蛋白，但我也是用了5ml的平衡液，作用了15min。
我现在也不知道哪里出现了问题，但是我觉得应该是聚焦没有完全，因为就算你泡胀时不均匀，根据等电聚焦的特性，任何位置的蛋白都可以到达其合适的位置(PI)，所以，我们是否该从等电聚焦上找一下原因。
另外，楼主你现在怎么样了？改进方法后结果有改观吗？请回，谢谢

作者: zhezhe 时间: 2014-6-26 17:12

泡胀不均匀的示意图，如果泡胀成这个样子了，“根据等电聚焦的特性，任何位置的蛋白都可以到达其合适的位置(PI)”这句话还成立吗？

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作者: whitesheep 时间: 2014-6-26 17:12

我也认为是聚焦时间不够所致，这样蛋白点不能完全跑开

作者: IAM007 时间: 2014-6-26 17:13

IEF结束后,观察一下胶条,如果中间那段没有完全泡涨(即肉眼可见中间那段厚度没有达到0.5mm),则最可能的原因是水化不全,可以延长水化时间.
另一个可能的原因:平衡不够, 2向转移不充分.如果2.5ml平衡液用于7cm胶条应该够了,但如果是17或24cm胶条,2.5ml平衡液太少了.时间我一般控制在12~15min.这个把握一下.另胶条和胶面接触良好,没有气泡也需要注意.再做一次看看结果如何?
一向上样时,基本上保证没有气泡,液体不中断也就够了.我觉得你图中的两种手势都可行的.
如果再重复出现这样的问题,也不排除胶条的相应部位有问题,这时换胶条试试.

作者: zhezhe 时间: 2014-6-26 17:13

谢谢各位大侠的帮助，这次我用了5ml的平衡液，聚焦时间加到70000伏小时，二相采取30maA，跑了九个半小时，（好长啊，等起来真累），
上样的时候，我是先放在溶胀盘里，然后十二小时后放在聚焦盘中（因为溶胀盘比较宽，损失了不少），
胶见图

[ 本帖最后由 zhezhe 于 2014-6-26 17:15 编辑 ]

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作者: ending 时间: 2014-6-26 17:15

改善了不少,恭喜一下!

作者: fei1226com 时间: 2014-6-26 17:15

最近跑出的胶和你的差不多，我的也是在缄性端出现类似的竖条纹，不知道到底是什么原因，还请大家帮助分析！

作者: orangecake 时间: 2014-6-26 17:16

请问你是用的17CM的胶条吗？二向你是用恒电流跑的？

作者: jujuba 时间: 2014-6-26 17:16

不知道大家用得什么材料，我用得植物材料跑得，一般都到16000vhr就停止聚焦了，有时候也会出现横纹，是不是聚焦时间很不够？是13cm的胶条。

作者: yjf1026 时间: 2014-6-26 17:17

那位老兄告诉我10％TCA丙酮如何配制？我刚开始作2－DE！谢了！

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