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标题: 【求助】我的蛋白基本上都在超声沉淀中.尿素不... [打印本页]

作者: biabiade 时间: 2014-6-26 17:44 标题: 【求助】我的蛋白基本上都在超声沉淀中.尿素不...

我用PET-30a载体中表达蛋白基本上都在超声沉淀中,8M尿素不能溶,还怎样处理呢?

[ 本帖最后由 biabiade 于 2014-6-26 17:46 编辑 ]

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作者: fsdd817 时间: 2014-6-26 17:45

你溶解的条件是什么呢？是要做复性还是纯化呢？
用7M盐酸胍试试，1g包含体用20ml裂解液，室温搅拌2h，然后离心弃沉淀，一般会溶解的。

[ 本帖最后由 fsdd817 于 2014-6-26 17:46 编辑 ]

作者: biabiade 时间: 2014-6-26 17:47

我想先纯化再复性,我是在PH8的8M的尿素中溶的,没有溶,那么这样的沉淀我能直接用盐酸胍溶吗?还有用盐酸胍溶后怎样处理才能电泳检测呢?谢谢帮助啊!具体的盐酸胍溶液是什么呢?

作者: kuohao17 时间: 2014-6-26 17:47

如果在尿素中不溶，这时的目的蛋白应该很纯了吧

作者: flower-201 时间: 2014-6-26 17:47

可以先用3M的尿素溶解杂蛋白，然后用6M的盐酸胍溶解沉淀再过镍柱纯化就可以了。我是这么做的，很好用，希望对你的实验有帮助：）

作者: jkobn 时间: 2014-6-26 17:48

加入还原剂

作者: 33号 时间: 2014-6-26 17:48

我用PET-30a载体中表达蛋白基本上都在超声沉淀中,8M尿素不能溶,还怎样处理呢?

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如果8M的尿素不能溶解的话，那么盐酸胍也不一定能溶。
我觉得不是8M的尿素不能溶解你的包含体，而是你包含体的处理过程可能出现问题了，下面是包含体处理的流程，你有时间试试吧。
1、首先是诱导表达后收集湿菌体重悬于PBS中。
2、然后是反复冻融3、4次（－80/40min、37/10min)
3、之后是超声，超声强度需要根据表达菌自己掌握。我的表达菌是BL21，超声强度是300W（10s/10s)
4、之后就是离心收集包含体，然后用洗涤液1，也就是含有曲拉通的那种洗涤一次，冰上30min。
5、之后离心然后用洗涤液2，也就是低浓度尿素（2M）洗涤一次，之后冰上30min。
6、之后离心收集沉淀，加入8M的尿素，然后每个EP管加入15－20ul的DTT，4度过夜。
7、然后离心去掉沉淀即可。
注意各段的样品都要留出少量跑page确定蛋白的存在状况以确定下一步方案。
以上仅供参考。

作者: biabiade 时间: 2014-6-26 17:49

为什么没有处理就不能溶呢?还有你的洗涤液具体是什么能否详细告诉我?我用8M尿素处理的沉淀应该很纯了吧,不能直接再处理吗?谢谢!

作者: 小糖块 时间: 2014-6-26 17:49

为什么没有处理就不能溶呢?还有你的洗涤液具体是什么能否详细告诉我?我用8M尿素处理的沉淀应该很纯了吧,不能直接再处理吗?谢谢!

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因为没有处理过的蛋白里面含有很多成分，你的目的蛋白只是其中的一部分而已，也就占到50％，所以溶解包含体之前要经过一个除去杂质的过程。
洗涤液1：20mM Tris-Cl(PH8.0)、 5mM EDTA 、4% TritonX-100
洗涤液B：20mM Tris-Cl(PH8.0) 、5mM EDTA、 2M 尿素
经过上面的处理液处理过之后在用8M的尿素溶解过夜（要加入DTT）。之后的包含体溶解成为可溶性的蛋白，然后再纯化或其它。

作者: biabiade 时间: 2014-6-26 17:50

请问你的PBS和8M尿素的配方是怎样的啊？谢谢！

作者: 小糖块 时间: 2014-6-26 17:50

QUOTE:

原帖由 biabiade 于 2014-6-26 17:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问你的PBS和8M尿素的配方是怎样的啊？谢谢！

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