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标题: 【求助】请教SDS-PAGE和WESTERN BLOT [打印本页]

作者: sunbent 时间: 2014-6-27 11:01 标题: 【求助】请教SDS-PAGE和WESTERN BLOT

各位，我做了几次SDS-PAGE和WESTERN BLOT,有几个问题总是出现，帮我看看是怎么回事吧！谢谢各位了！
1.用的是5％浓缩胶，12％分离胶，浓缩胶高度约齿下0.5厘米，分离胶高度约6.5厘米。浓缩胶电压40V,分离胶电压80V,浓缩胶30分钟就跑完了，分离胶2小时就跑完了。这个速度是不是太快了？
2.我用的是北京六一厂生产的电泳槽，不需要用琼脂糖封胶，但每次取下封边条后凝胶底部两玻板之间总有气泡，很难排干净。怎么办呢？
3.每次考染后都发现样品跑歪了，尤其是MARKER,歪到别的泳道上去了。怎么回事呀？
4.今天我封闭时不小心将膜的蛋白面朝下振荡了1小时，后来想起来了才将面翻过来。这对实验有没有影响啊？为什么一定要膜的蛋白面朝上呢？

作者: tangxin_80 时间: 2014-6-27 11:02

1.速度不应该算太快，我们跑浓缩胶时用的是90v的电压，而分离胶是120v的电压一样很好。
2关于六一厂的电泳槽排气泡问题，我有个绝招，就是在到电泳buffer的时候，先倒外槽的液体，并且将槽子倾斜着倒，这样随着液面的上升，气泡逐渐就被赶出来了，我每次用的时候效果都不错的，可试试看。
3上样的时候应该保证各个lane的样品量一致，有人主张将MARKER也补齐同样的体积后上样，我个人觉得无所谓，可以上到边上或在两个样品量相同的LANE中间就可以了。
4只要膜不是贴的很紧，面朝下振荡应该对试验结果没什么影响，面朝上是为了保证与封闭液的充分接触。

作者: 蒲公英 时间: 2014-6-27 11:02

你的胶和缓冲液的配方可不可以告诉一下？怎么跑的那么快的啊？
我的是恒流的，20mA,而每次电压都会升到140V，要跑三四个小时才跑完。我感觉我的胶或者缓冲液有问题啊

作者: sunbent 时间: 2014-6-27 11:03

QUOTE:

原帖由 tangxin_80 于 2014-6-27 11:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1.速度不应该算太快，我们跑浓缩胶时用的是90v的电压，而分离胶是120v的电压一样很好。
2关于六一厂的电泳槽排气泡问题，我有个绝招，就是在到电泳buffer的时候，先倒外槽的液体，并且将槽子倾斜着倒，这样随着液面的上升，气泡逐渐 ...

你说得上样量一样是指的上样体积吗？样品老是跑歪与胶底下有气泡有没有关系呀？另外，膜的蛋白面朝下的话，蛋白有没有可能在平皿表面磨掉了呀？（不好意思，这个问题是不是有点可笑？但我的确有点担心。）

作者: sunbent 时间: 2014-6-27 11:04

QUOTE:

原帖由 蒲公英 于 2014-6-27 11:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你的胶和缓冲液的配方可不可以告诉一下？怎么跑的那么快的啊？
我的是恒流的，20mA,而每次电压都会升到140V，要跑三四个小时才跑完。我感觉我的胶或者缓冲液有问题啊 ...

我是照分子克隆上配的试剂。
5*电泳缓冲液300ml：tris 4.53g,甘氨酸 28.3g,10%SDS 15ml,配置成300ml，并调ph为8.3.
12% 分离胶15ml:水 4.9ml,30%acr-bis 6.0ml,1.5Mtris-cl(ph8.8) 3.8ml,10%SDS 0.15ml,10%ap 0.15ml,TEMED 0.006ML.
5%浓缩胶5ml：水 3.4ml,30%acr-bis 0.83ml,1.0MTris-cl(ph6.8) 0.63ml,10%SDS 0.05ML,10%AP 0.05ml,TEMED 0.005ml.
我用的是恒压。你的电泳槽是不是跟我的不一样？我的槽子较小，１5ml分离胶可以倒２块胶。

作者: duoduo 时间: 2014-6-27 11:04

你用的是1mm的板还是0.75mm的板？我在做的时候发现薄板有可能出现气泡，但是对结果没有什么影响。结果跑歪了有可能是你的缓冲液的问题，会不会是没有加够量。也有可能是你的玻璃板的问题，你把玻璃板用重铬酸钾洗液泡0.5～1h（不要泡时间长了，否则粘上的玻璃条很容易掉下来的），然后用自来水冲净后再用蒸馏水冲洗，直至无水珠挂壁，晾干后再用。膜的蛋白面朝下的话一般没有问题，我做的时候都是两块膜一起漂的，背对背的，一个面朝上，一个面朝下，都没问题。

作者: duoduo 时间: 2014-6-27 11:04

QUOTE:

确保你的缓冲液pH值和离子强度都没问题，我一般情况是浓缩胶用10mA稳流（此时电压在35V左右），分离胶用75V稳压，好像也是4h左右。

作者: mimili_901 时间: 2014-6-27 11:05

1.不算快吧，我们用的是3%浓缩胶，12%分离胶，浓缩胶110V，30分钟。分离胶140V ，50分钟就跑完了，最后结果很满意。

作者: sunbent 时间: 2014-6-27 11:05

我用的是1.5mm的板。玻板真的可以泡一下酸吗？原来老式的玻板我是泡酸的，这种玻板上面粘了玻璃板，我不敢泡。但我的玻板上的确有水珠挂壁。
我作了两次western blot，用DAB染色，都没有结果。很沮丧。有几个问题想请教各位高手，帮帮我吧！
1.所有的装试剂的瓶子都要高压灭菌吗？
2.文献是用的ECL的显色方法，但此方法对我来说有困难。听人说一定要先用DAB染出一点条带再上ECL,是这样的吗？

作者: 蒲公英 时间: 2014-6-27 11:05

我用的槽子跟你的应该是一样的，15ml做两块胶，可我的分离胶用140V跑出来全糊了！晕啊。我的老是觉得慢！还是要比较久。

作者: tangxin_80 时间: 2014-6-27 11:06

上样量一样就是指的上样体积，但蛋白浓度此前应该调整为一致的，这样体积和浓度全一致，跑出的条带才能够保持一致。
样品老是跑歪与胶底下有气泡应该是有关系的。
膜的蛋白面朝下的话，蛋白一般不会在平皿表面磨掉，如果不放心最好翻过来蛋白面向上放置，当然最好是这样放的啦。: -)

作者: 蒲公英 时间: 2014-6-27 11:06

开始把气泡全赶掉了，但是跑的过程中还是会有气泡，怎么办？

作者: windy+++ 时间: 2014-6-27 11:06

关于SDS-PAGE的marker总是跑歪，我也遇到过这种情况．后来我尽量不把 marker上在最左或最右的泳道，其次上样的时候尽可能上一个泳道隔一个泳道，同时隔出来的泳道不要空着，也上一定体积的loading buffer．另外，　　marker中也可以加入适量的loading buffer，我这样做了以后觉得跑出来的图效果还不错．

作者: 蒲公英 时间: 2014-6-27 11:07

你的电泳跑的好象有些快！“浓缩胶高度约齿下0.5厘米，分离胶高度约6.5厘米”浓缩胶的距离是不是小了点，这样可能在你拔梳子时候使浓缩胶与分离胶之间松动，试试1CM 吧！

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