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标题: 【求助】怎样证明一段序列为酶的底物结合区？ [打印本页]

作者: bohe221 时间: 2014-6-27 15:17 标题: 【求助】怎样证明一段序列为酶的底物结合区？

大家好！
我想证明一个蛋白片断是该酶的底物结合区，但是序列比对没有结果。请各位师兄师姐指点一下，通过什么试验可以证明呢？

作者: lxh031 时间: 2014-6-27 15:17

不太清楚你说的序列比对没有结果什么意思，是指该酶中没有此蛋白片断序列或同源序列吗？该酶的底物结合区你是不是不知道啊？
或许你可以将此蛋白序列连接到其他无关蛋白如GST上，看它是否与底物有结合？如果知道该酶的底物结合区，则用这个蛋白片断替换掉此结合区，看其是否仍具有结合底物活性？
你提供的信息太少了，以上也仅是我个人一点想法，希望有用。

作者: bohe221 时间: 2014-6-27 15:18

不好意思，是我没说清楚。
我有一段基因序列，blast比对结果显示，除含有完整的酶的催化域之外，还含有100个氨基酸的未知功能的区域，这300bp的序列比对没有跟谁有同源性。我怀疑这是一段底物结合区，但是不知道通过什么试验证实我的想法。
通过什么方法检测它是否与底物结合呢？

作者: bohe221 时间: 2014-6-27 15:18

关于此酶的底物是已知的吗？
如果是已知的话那就好办些。你可以如我前面所说，去掉这100个aa，看还是否具有与底物结合的能力，或者单独拿出来100aa与GST偶联看是否能够pulldown下底物来？
如果此酶的底物也是未知的话，那首先就是要找到此酶的作用底物了。可以首先用酵母双杂交进行广泛筛选，对一些有意义克隆再单独进行验证，主要就是验证蛋白相互作用的一些方法，如IP，GST PULLDOWN等。然后就是对此酶进行区域分段利后酵母双杂交来寻找与底物的结合区域，然后其他方法进行验证，等等。
总之就是蛋白相互作用的验证。

作者: bohe221 时间: 2014-6-27 15:18

我已知酶的底物，我想问的就是：去掉这100个aa后，通过什么方法，怎样看它是否与底物有结合能力。除了拿他去pulldown底物之外，还有什么方法吗？
非常感谢！！

作者: lxh031 时间: 2014-6-27 15:19

不客气，我也是恰好在做这块儿
pulldown之外你也可以用酵母双杂交啊，把去掉这100aa的序列构建到BD vector,底物构建到AD vector，共转化酵母细胞。哺乳动物双杂交也可以，你可以找找相关的资料。

作者: bohe221 时间: 2014-6-27 15:19

我的底物是多糖，不是蛋白。

作者: lxh031 时间: 2014-6-27 15:20

那我就不知道了，没做过多糖
呵呵

作者: bohe221 时间: 2014-6-27 15:20

还是非常感谢你！非常感谢！
那请问pulldown能用蛋白pulldown多糖吗？
pulldown好上手吗？

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