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标题: 【求助】干扰素的纯化 [打印本页]

作者: gemei0115 时间: 2014-6-27 15:22 标题: 【求助】干扰素的纯化

小弟最近在学习人重组干扰素的纯化，有些问题想请教各位前辈
以下是一个初纯干扰素的方法：细胞破碎：将重组大肠杆菌溶于缓冲液，进行细胞破碎后，离心，取上清——〉酸化：调pH至2.0，离心，取上清——〉中和：调pH至7.0，取上清——〉盐析
我想问一下，上面这套纯化工艺中，酸化的目的是什么？利用的是什么原理？
个人认为应该是除去一部分杂质蛋白，不过不知道是除去哪些蛋白呢？

作者: nut6694 时间: 2014-6-27 15:22

这种纯化工艺实在没见过，百思不得其解，请问你从哪里参考来得。这个工艺不像纯化蛋白的，倒像是提取有机物的

作者: gemei0115 时间: 2014-6-27 15:25

这是一家生物公司的生产工艺，是一套比较老的生产工艺了

作者: gemei0115 时间: 2014-6-27 15:25

酸化这一步应该是根据干扰素蛋白耐酸性较强，从而使一些耐酸性较差的杂蛋白，变形沉淀。各位觉得这么解释对吗？
还有就是这步具体能除掉什么蛋白呢？这是我比较不了解的。

作者: xyw5 时间: 2014-6-27 15:26

呵呵是够另类的纯化请问楼主做的是哪种干扰素 a族还是？
我做过a族的酸性条件下干扰素容易聚集形成多聚体相反碱性条件下更稳定一些。小于9的ph 对活性影响不大酸性条件下不宜长久保存。
你按照这样的工艺做酸化前后纯度如何？
建议你作个对比看看不经酸化的和酸化的干扰素纯化结果活性和蛋白纯度关系。

作者: gemei0115 时间: 2014-6-27 15:26

我做的是a1b，你做的是什么啊？

作者: shenkunjie 时间: 2014-6-27 15:27

酸化这一步应该是根据干扰素蛋白耐酸性较强，从而使一些耐酸性较差的杂蛋白，变形沉淀。各位觉得这么解释对吗？
还有就是这步具体能除掉什么蛋白呢？这是我比较不了解的。

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但是用这么低的pH，耐酸再强，也容易变性啊，当然没有做过，不敢乱说
一般干扰素a1b的纯化工艺是比较成熟的，也没有什么特殊的地方，文献可以查到很多，主要是包含体复性、透析、离交、疏水等等，酸化确实没见过。

作者: jujuba 时间: 2014-6-27 15:27

楼主的这个工艺是从提取白细胞干扰素的工艺中移植过来的。白细胞干扰素的含量非常低，利用I型干扰素抗酸的特点，在上游工艺中设计了酸化这个步骤，可以去除很多不耐酸的杂蛋白；后续的离子交换等纯化步骤还是需要的。阿尔法干扰素在pH2酸性环境下可以稳定十数小时，形成的聚合体不至于沉淀而且可以在中和后部分还原。
在重组干扰素产业化进程当中，早期工程菌的表达量很低，90年代的前半段，国内外很多厂家在纯化工艺中不得不采用单克隆亲和层析技术，亲和层析的洗脱液多采用的也就是1%冰醋酸。
酸化能够出去哪些杂蛋白，如楼上所言，电泳比较一下酸化前后样品，即可知道。至于去除的蛋白究竟是什么蛋白，这个问题毫无意义，评价一个纯化步骤的效果主要是看目标蛋白的纯度提高和回收率。

作者: PINK 时间: 2014-6-27 15:28

有一些多肽的提取用有机溶剂萃取,更变态,我搞生化的看着都觉得好奇怪的,根本想都不会想到的.不知道那帮人是怎么想出来的.

作者: xyw5 时间: 2014-6-27 15:28

QUOTE:

原帖由 gemei0115 于 2014-6-27 15:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我做的是a1b，你做的是什么啊？

a2a
a2b
呵呵 a1还真没有做过相关纯化工作。。

作者: avi317 时间: 2014-6-27 15:38

呀这么多ＩＦＮ高手呀，，，我作了融合干扰素．．能够复性后跑非还原电泳，，有单条带，，但是好象没有活性．．融合标签是ＰＥＴ３２的　是不是他对活性产生了影响呀．．
还有他复性很难呀，，就是低浓度的脉冲稀释也不容易复性（几乎回完全沉淀）
复性液是万金油体系
怎么办呀，，各位老师可以指点一下吗

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