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标题: 【求助】如何从SDS-PAGE胶中提取蛋白质 [打印本页]

作者: njkph 时间: 2014-6-27 15:54 标题: 【求助】如何从SDS-PAGE胶中提取蛋白质

本人最近在做蛋白纯化，请教各位如何从SDS-PAGE胶中提取蛋白质。曾看到有帖说可以捣碎凝胶，加缓冲液提取。能否请问一下哪位高手具体方法如何。很急！！！多谢！！！

作者: wu11998866 时间: 2014-6-27 15:55

可以用电洗脱至透析袋的方法。
1 透析袋先用蒸馏水煮沸30min。
2 将你要的蛋白条带切下来，然后切成小块，装入透析袋中。将染色的蛋白条带也放入透析袋中。透析袋中加入适量的缓冲液，透析液不宜过多，刚好使凝胶切片始终保持与缓冲液接触就可以了。
3 透析袋两端用透析袋夹夹紧，避免存留气泡。
4 把透析袋浸泡在盛有一浅层缓冲液的水平电泳槽中，用玻璃棒防止透析袋漂浮，40mA电流持续45～60min，直至染色的条带完全退色为止。
5 倒转电泳的电极再电泳1min，使蛋白从透析袋上释放出来，然后停止电泳。
6 然后将透析袋中的缓冲液洗出来，一般浓度比较小，可以进行冷冻干燥浓缩。

作者: wood533 时间: 2014-6-27 15:55

问一个比较外行的问题，是不是这样纯化的蛋白量比较少啊？再有冷冻干燥浓缩会不会是蛋白变性啊？
小弟最近才开始接触蛋白的这些实验，还有好多不是很明白的，希望能被指点，谢谢了！

作者: vcve 时间: 2014-6-27 15:55

我们实验室的方法，切下蛋白相对应PAGE胶，切碎，液氮中研磨至粉末状，加入8M尿素溶解后离心，回收效率很高的，只是回收的都是变性蛋白。

作者: wu11998866 时间: 2014-6-27 15:56

我们实验室的电洗脱至透析袋的方法回收效率不高，都是变性蛋白。但是看你纯化蛋白的用途是什么了，这种纯化方法得到的蛋白可以用来免疫动物制备抗体。

作者: INK 时间: 2014-6-27 15:56

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头痛
我最近也一直在做SDS-PAGE，下一步也要免疫动物制备抗体，正在头疼怎样才能快速的得到比较纯的蛋白？
从SDS－PAGE中回收的是变性蛋白，能直接用于免疫动物制备抗体吗？要不要经过处理一下呢？免疫实验对蛋白都要那些要求啊？
请战友们指点一下谢：）

作者: INK 时间: 2014-6-27 15:56

我们实验室的方法，切下蛋白相对应PAGE胶，切碎，液氮中研磨至粉末状，加入8M尿素溶解后离心，回收效率很高的，只是回收的都是变性蛋白。
我们实验室里没有液氮，冰块可以么？加入尿素的作用是什么呢？

作者: wu11998866 时间: 2014-6-27 15:57

从SDS－PAGE中回收的蛋白可以直接用于免疫动物制备抗体，与福氏完全佐剂混合免疫动物即可。但是这样制备出来的抗体是多克隆抗血清，这就要看你对抗体的要求了。

作者: INK 时间: 2014-6-27 15:57

多谢指教！我还有两个问题：
1、我现在准备做单克隆抗体，从SDS-PAGE中回收的以单一条带蛋白（已变性）与层析柱纯化后（条带也很单一，有活性）的蛋白相比较，有什么不同呢？
2、我从文献上看到，免疫动物制备抗体时，用兔子实验时得到的是多抗，而用bable老鼠则得到单抗，这是为什么呢？是不是与动物种类有关啊，要是的话，还有哪些可以用来制备单抗呢？
我原来理解，制备的抗体是由蛋白的纯度决定的，含蛋白种类越多（有杂带）则得到多抗，蛋白纯度高（条带单一）得到的就为单抗．现在有点晕了～～～～～～：）
初涉这方面的实验，很多都不太理解，还请前辈们多多指教！

作者: nvdabing 时间: 2014-6-27 15:58

1.我回答一下上面的问题。抗体和你的蛋白抗原结合是与其上抗原表位结合。如果是线性表位还好。两种蛋白都有。如果是构象表位。变形蛋白中是不存在的。

作者: nvdabing 时间: 2014-6-27 15:58

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腹水多发性骨髓瘤
2。单克隆抗体是针对单一抗原表位的，一般由腹水或者融合的杂交瘤上清获得。多克隆抗体一般由以成功免疫的动物的血清获得。兔子由于没有腹水，而且没有可以用于融合的骨髓瘤（这个骨髓瘤是我们公司的专利）。所以一般兔子抗体都是由血清获得的多抗。

作者: bluelake 时间: 2014-6-27 15:58

请问楼上的，如果我要从SDS-PAGE上回收蛋白的话，是考染后（经染色脱色，可能要好几天）回收好呢，还是怎么办？（听说有一种用KCL染的方法阿）
还有就是用电泳回收的效率太低，免疫兔子需要1mg/Kg，得跑大概多少胶
我的目的是回收蛋白亚基制成抗体，望指点

作者: INK 时间: 2014-6-27 15:59

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多发性骨髓瘤

我要表达的是从啤酒中提取的一种约40kDA的蛋白,其表位是线性的还是构像的我不清楚，没有查到，可能要用层析柱纯化蛋白比较放心！
多谢yager2500 兄不吝赐教，我现在正在用层析柱纯化蛋白，然后再用bable mice 免疫制备抗体：将蛋白注入老鼠体内，后将其脾脏取出与骨髓瘤融合，再screening and cloning repeatedly，后再将杂交瘤注入老鼠体内，制备腹水，最后再从腹水中纯化单抗抗体。
我实验最终要的就是一定量的这种单抗，以可以用来检测beer中的40kDa蛋白！
想请问一下，我这种想法能实现吗？中间有有问题的地方吗？
有没有比较快少花时间的其他方法呢？
可以帮我分析一下吗？

作者: nvdabing 时间: 2014-6-27 15:59

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腹水
你的想法听来应该没问题.
只是你是天然蛋白注射免疫的.可能其上存在不止一个表位.所以可能融合后会产生针对不同表位的好几种抗体.
我觉得你最好先在杂交瘤融合稳定以后先挑出有阳性的单克隆.然后将这些杂交瘤全部冻存.只取一株进行腹水生产.然后检测.能检测到最好.你就算达到实验目的.检测不到再换别的.小鼠应该不会太贵吧.
有机染料（丽春红、酰胺黑、坚牢绿、考马斯亮蓝），荧光染料（荧光胺、香豆素）和胶体微粒（金、银、铜、铁或印度黑墨汁）。这些染料可分为可逆和不可逆染料。通常不可逆染料的灵敏度最佳，但它干扰或无法对蛋白进行进一步分析。不可逆染料的实例有酰胺黑和考马斯亮蓝。可逆染料尽管灵敏度较低，但它允许评估胶后从胶上将其洗除。最常用的可逆蛋白染料是立春红。如果靶蛋白丰度太低，则无法用染色法检测到，但对于较高丰度蛋白，染色法通常可以体现蛋白的转移情况。
这是我看到的粗略的资料.你要尽量挑一种染色灵敏度高一点.然后不影响你后续操作的可逆燃料.我们由于不需要后续操作.都是用考马斯亮蓝.你要再仔细挑选.我有时间也会看的.只是现在工作了.晚上才能看看.

作者: njkph 时间: 2014-6-27 16:00

cuturl('http://www.ebiotrade.com/newsf/2003-10/B20031031163317.htm')
这里面介绍了一些回收蛋白的试剂盒.我们公司里要用一般都是试剂盒.你们的经费上如果允许也可以考虑.
<<一种利用普通垂直电泳槽回收PAGE胶蛋白条带的简便方法>>.这是一篇文献.你也可以查来看看.
免疫兔子前前后后可能最少要15mg吧．SDS-PAGE的回收大概就是２０％的效率．这样你就需要多一些蛋白．最好你能过量加下去．保证回收到需要的量．
另．你准备一条走天然蛋白，一条走变性蛋白么？这样也好．抗体的具体信息到时候可以比对．表位作图之后说不定还能得到抗原上的表位信息．

作者: INK 时间: 2014-6-27 16:00

但文献上记载，一个蛋白上的几条亚基的免疫原性可能相同，用其中一条亚基免疫兔子，怕的是得到的抗体与其他几条亚基也能免疫上，这样就不能从细胞中免疫定位上了，看看有没有其他的方法阿
还有考马斯亮蓝和SDS对蛋白亚基的免疫原性没有影响吗？这样蛋白亚基的构象不就改变了吗？是不是需要除去考马斯亮蓝和SDS才能用来免疫兔子呢？

作者: njkph 时间: 2014-6-27 16:01

你说的不同亚基的问题。我想了想是不是可以这样理解。如果是整个蛋白免疫。那么得到的抗体中肯定有一部分线性或者构象表位是由几个亚基之间联结的部分构成。现在既然已经是亚基了。那么制备出的抗体。应该没有问题。就是针对亚基内部的构象或者线性。那么你再用于检测的时候应该就是单一检测到那个亚基。或者带有那个亚基的整个蛋白。不会识别其他亚基。
考马斯亮蓝和SDS当然对蛋白质亚基的免疫原性有影响。SDS会让蛋白质变形的。如果你要制备针对现行表位的抗体没关系。但是要针对天然构象表位的，那肯定不行。除掉SDS后蛋白也不一定就能正确折叠复性的。这很难说。最好开始就不要接触到这些东西。可以选择丽春红一类的可逆燃料。电泳分离用非变性胶。
也不知道我说的又没有问题。有没有高人指正或者肯定一下呢？

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