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标题: 【求助】BCA法蛋白定量步骤（用酶标仪） [打印本页]

作者: luoliqiong 时间: 2014-6-28 09:21 标题: 【求助】BCA法蛋白定量步骤（用酶标仪）

请问用BCA法蛋白定量的步骤（用酶标仪）

作者: huifeng0516 时间: 2014-6-28 09:22

1. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
2. 完全溶解蛋白标准品，取10微升稀释至100微升，使终浓度为0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀
  释。但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。
3. 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20微升加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20微升。
4. 加适当体积样品到96孔板的样品空中，加标准品稀释液到20微升。
5. 各孔加入200微升BCA工作液，37℃放置30分钟。
  注：也可以在室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应
  会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。
6. 测定A562，540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出蛋白浓度。

作者: luoliqiong 时间: 2014-6-28 09:23

加适当体积样品到96孔板的样品空中，加标准品稀释液到20微升。
应该是加适当体积样品到96孔板中，补加PBS到20ul，而不是用标准品稀释液补加吧

作者: zsxan1990 时间: 2014-6-28 09:23

我们的方法是这样的
事先配好各个浓度的bsa标准品，
step 1
A液和B液按 50：1混合，（比如你要测2个样品，可以是6个标准曲线点 0，0.05，0.1，0.2，0.5，1mg/ml，加上2个样品，也就是8个孔，做平行就是16孔，那么取A液取16*0.2=3.2ml，B液取64ul 混合就ok了）
step2
每孔加200ul混合液，然后标准曲线孔加入25ul标准品，样品稀释到合适的比例，也加入25ul（如果图省事的话，比如也可以加1ul样品，再加24ul水补齐，加样的时候可能不会太准）
step3
37度孵育30min
step4
测 od 565，附近也行

作者: zsxan1990 时间: 2014-6-28 09:23

还有就是BCA方法其实是有不少限制因素的，比如蛋白溶液里面有去垢剂，还原剂（DTT，巯基乙醇，）测得数值就很不准
据说最好的办法是氨基黑法

作者: nvdabing 时间: 2014-6-28 11:44

BCA对去垢剂的耐受性还是不错的！

作者: NBA 时间: 2014-6-28 11:45

补充一小点：最好是先加20ul的蛋白再加200ul的工作液，这样有助于更好的混匀。否则有可能会发现反应完后会分两层，上层呈微紫色，下层颜色不明显。
助实验顺利：）

作者: yhz1973 时间: 2014-6-28 11:45

请问用BCA法蛋白定量的步骤（用酶标仪）

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这个方法太麻烦了，每次都要配BSA样品，还要先做标准曲线，最好能有考马斯比色

作者: 987789 时间: 2014-6-28 11:46

混匀的问题，可以在参数中选择快速震荡，30s就可以了
做的好的话可以达到4个九

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