标题:
【求助】免疫共沉淀的假阳性是怎么产生的?
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作者:
wanglaoshi
时间:
2014-7-5 18:14
标题:
【求助】免疫共沉淀的假阳性是怎么产生的?
免疫共沉淀的假阳性是怎么产生的?
各位大侠,假阳性是在哪一步产生的阿?
急用!
谢谢了!
作者:
wanglaoshi
时间:
2014-7-5 18:14
还有就是谁有免疫共沉淀 的具体一点的protocal?
可否给我看一下?
谢谢!
作者:
lixi559
时间:
2014-7-5 18:14
我也刚准备做这东西,
我想假阳性产生是因为抗体的特异性不高,
结合了其他非目的蛋白.
想听听高手意见
作者:
lixi559
时间:
2014-7-5 18:14
这篇protocol还不错
可以参考一下
作者:
bs4665
时间:
2014-7-5 18:15
丁香园里有很多:cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/search#result')
列几个:
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/4286638')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/4070885_0.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1454279_0.html')
作者:
memory
时间:
2014-7-5 18:15
免疫共沉淀的假阳性是怎么产生的?
各位大侠,假阳性是在哪一步产生的阿?
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分析一下COIP的步骤,我觉得可能是这些情况
1,beads没洗干净,或者某些蛋白容易吸附在beads上
2,用于IP的抗体特异性不高,与某些蛋白有交叉反应
3,用于IP的抗体杂带被WB的抗体检出,而分子量与你的目的蛋白相近
4,WB用的抗体特异性不高,与某些分子量接近目的蛋白的杂蛋白蛋白有交叉反应
5,假设你IP蛋白A用WB检测蛋白B,而A和B分子量相近,而WB中所用的抗体又和A有一些交叉反应,这时候在B的位置上也会有淡淡的条带。。。(听上去好像很少见,但我也遇见过)
所以对照是要好好设计的,至少我做的时候会加这些对照
1,只有蛋白A,没有蛋白B的系统
2,只有蛋白B,没有蛋白A的系统
3,没有A,B,单加抗体的系统
4,没有A,B,抗体,单加beads的系统
5,如果用A成功COIP下来B,那么反过来尝试用B COIP A
此外,必要时还换不同的tag,不同的抗体,不同的细胞系统,buffer,诸如此类
作者:
wmp1234
时间:
2014-7-5 18:16
一些实验指南上面还有IgG轻链和重链的条带,在实际工作中和目的条带如何区分?
是不是同一种属来源的抗体IgG大小都应当是恒定的?如果是的话,mouse、rat和rabbit的大小又分别是多大呢?
作者:
memory
时间:
2014-7-5 18:16
一些实验指南上面还有IgG轻链和重链的条带,在实际工作中和目的条带如何区分?
是不是同一种属来源的抗体IgG大小都应当是恒定的?如果是的话,mouse、rat和rabbit的大小又分别是多大呢?
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一般IGg轻链和重链大约在20和50左右,由于变性条件不同,在没有加2-ME或者DTT之类不完全变性的情况下在分子量较高的地方也会有条带,当IP和WB用同一种属的抗体时尤其明显
如果同时做一个不加细胞裂解液,单有抗体和beads的对照,就能区别出这些抗体带了。如果抗体带很强,遮盖了目的条带或者影响了结果观测,只能想办法换抗体,换实验条件
作者:
wmp1234
时间:
2014-7-5 18:16
QUOTE:
原帖由
memory
于 2014-7-5 18:16 发表
bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '
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')
一些实验指南上面还有IgG轻链和重链的条带,在实际工作中和目的条带如何区分?
是不是同一种属来源的抗体IgG大小都应当是恒定的?如果是的话,mouse、rat和rabbit的大小又分别是多大呢?
=================================== ...
多谢解答,继续问问:如果在沉淀物中同时加入A、B(假设二者的确存在相互作用)各自对应的一抗和二抗,是不是最后的显色结果应当同时出现IgG、A、B三条带?
谢谢。
作者:
pencil菲
时间:
2014-7-5 18:17
IP的抗体和WB的抗体来自不同种属就不会出现IgG的轻链和重链了吗?比如,用兔的多克隆抗体沉淀,用鼠的单克隆抗体做WB,还会出现轻链和重链吗?
偶联到Beads上的ProteinA或ProteinG在变性处理时会不会从Beads上脱落?如果会,那么WB时就会出现条带。大家有碰到这种情况的吗?
作者:
9900
时间:
2014-7-5 18:17
IP的抗体和WB的抗体来自不同种属就不会出现IgG的轻链和重链了吗?比如,用兔的多克隆抗体沉淀,用鼠的单克隆抗体做WB,还会出现轻链和重链吗?
偶联到Beads上的ProteinA或ProteinG在变性处理时会不会从Beads上脱落?如果会,那么WB时就会出现条带。大家有碰到这种情况的吗?
同问!
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