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标题: 【求助】求教一个问题 [打印本页]

作者: hyuu 时间: 2014-7-8 11:11 标题: 【求助】求教一个问题

我现做WB跑电泳时虽然能暴光得到条带，但位置比以前高了，几乎是2倍，开始怀疑是上样缓冲液的2ME，但用了新的2ME情况仍然一样（位置比以前高了，几乎是2倍），重新配制SDS分离胶缓冲液、SDS浓缩胶缓冲液后情况也一样（位置比以前高了，几乎是2倍），现在正在疑惑中，是什么原因导致这种情况出现呢？又应该怎么样解决呢？请高手指点一二（附带说明你用的上样缓冲液的配方），急等回复，不胜感谢！
现附上图片如下，图片解释：左上、右上、右下为以前的跑的胶，中上、左下为最近跑的胶。在同一实验室做的，相同的组织蛋白，同一种仪器，相同的电压，但所使用的试剂配液有所不同，请高手们帮忙分析一下，如果还需要什么信息就请回帖，我会回复的。

图片附件: 29772577.snap.jpg (2014-7-8 11:11, 23.58 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=25485

作者: bring 时间: 2014-7-8 11:12

蛋白并没有变化！！看看你的marker，是你的胶浓度有变化！！原来的胶比较稀，后来的胶有变浓了！！

作者: hyuu 时间: 2014-7-8 11:12

前后配制胶所需试剂加入的量相同。胶浓度有影响的主要是30%的母液，你是怎么配制的呢？称取两种物质共15g，依你的意见是定容到50ml还是直接用50ml来溶解？

作者: bring 时间: 2014-7-8 11:13

当然是定容啦！
你的两块胶估计不是用的一次的30％胶，这样的话只能通过MARKER来比较！

作者: hyuu 时间: 2014-7-8 11:13

大家注意看，是有Marker的。还有高见吗？

作者: DNA 时间: 2014-7-8 11:13

大小是一致的,只是你用了不同浓度的分离胶,也有可能跑电泳的时间相关较大引起的.不要看条带在分离胶上所在的位置, 你只要看marker的第三条带, 我觉得比较清楚的.
建议你用相同的胶浓度和电泳时间再看看.应试是没能差别的!
good luck!

作者: hyuu 时间: 2014-7-8 11:14

配制分离胶时各成份比例相同，如果说分离胶浓度不同，30%母液存放时间不同会影响分离胶的浓度吗？

作者: nn255 时间: 2014-7-8 11:14

你的蛋白大小并没有变，大小是靠迁移率来决定的，你的MARKER中的几个蛋白的迁移率换算后应该和你以前的一样。
注意你的凝胶时间和TEMED的用量，当胶凝的太快即使你配的是15%的，跑出来的效果可能不到10%

作者: hyuu 时间: 2014-7-8 11:15

两次跑胶时溴汾蓝在相同的时间内跑完，两种条件下跑的速度是一样的，这又如何解释呢？

作者: bring 时间: 2014-7-8 11:15

这种问题我也遇见过，主要是由于分离胶BUFFER的pH值有问题，最好是用新的浓盐酸配成1N的盐酸在按配方配制。
如果分离胶的pH偏低，会导致甘氨酸的解离度偏低，这时甘氨酸的速度就变慢了，就无法成为前导离子了。
由于溴酚兰、蛋白都无法超过甘氨酸，就会导致溴酚兰和小分子量的蛋白都压在甘氨酸那。
所以这时溴酚兰的速度实际上被甘氨酸压慢了，当溴酚兰跑到底时，就会比正常时跑得时间长，大分子量的蛋白当然就跑得靠下了！

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