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标题: 【求助】跑230kd蛋白的WB中的问题求助 [打印本页]

作者: whitesheep 时间: 2014-7-8 15:41 标题: 【求助】跑230kd蛋白的WB中的问题求助

各位前辈，我最近在跑分子量大约在230kd的蛋白，用的6%的SDS-page的胶，80V跑2-3小时，200mA转膜3.5h，一抗用5%BSA稀释1:1000,4°孵育过夜，二抗1:2000牛奶稀释，孵育1小时，TBST洗膜三次，每次10分钟，结果膜上一点痕迹都没有，求助各位大侠，跑230kd的蛋白有什么技巧吗？

作者: redbutterfly 时间: 2014-7-8 15:41

不知在下用的是半干转还是湿转。半干转可以告诉你条件。还有你的蛋白样品和抗体

作者: duoduo 时间: 2014-7-8 15:42

不用转那么久吧。400mA 1h就可以了。
抗体好不好？

作者: whitesheep 时间: 2014-7-8 15:42

用的湿转的，抗体是CST的，用5%BSA稀释1:1000

作者: whitesheep 时间: 2014-7-8 15:43

那一般转多久？还有什么其他需要注意的？抗体是CST的，应该还可以的，新买的

作者: redbutterfly 时间: 2014-7-8 15:43

半干转，230的分子量用18V恒压转两个小时，封闭一小时.二抗一小时。二抗稀释比例调一下。不知上样量是多少。蛋白样品怎么样。跑个电泳染个胶看看，我没有用过湿转。半干转我260的都做出来了！希望对你有所帮助。

作者: redbutterfly 时间: 2014-7-8 15:43

打错了，是16V.恒压转。电转液提前四度遇冷。博乐转膜仪可以在方形那放置冰袋。甲醇泡膜时间延长到8分钟。

作者: duoduo 时间: 2014-7-8 15:44

各位前辈，我最近在跑分子量大约在230kd的蛋白，用的6%的SDS-page的胶，80V跑2-3小时，200mA转膜3.5h，一抗用5%BSA稀释1:1000,4°孵育过夜，二抗1:2000牛奶稀释，孵育1小时，TBST洗膜三次，每次10分钟，结果膜上一点痕迹都没有，求助各位大侠，跑230kd的蛋白有什么技巧吗？

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western的几个问题:
1. postive control
你是否确定你的样品里面有230kd的这个蛋白表达？比如说过表达的样品。我相信你没有。
你是否确定你的抗体是好的？比如过表达一个flag tag的，然后看flag能否杂出来。
确定之后再来做trouble shooting

作者: whitesheep 时间: 2014-7-8 15:44

万分感谢！我上样量在25μL左右，蛋白50μg，NC膜也要甲醇泡膜吗？师兄他们说不需要的，所以我一直都没有泡过，我会调整下再试试。万分感谢

作者: redbutterfly 时间: 2014-7-8 15:45

nc膜适合一些小分子量的蛋白。大分子的用PVDF膜吧！NC膜太脆了！

作者: whitesheep 时间: 2014-7-8 15:45

各位前辈，我最近在跑分子量大约在230kd的蛋白，用的6%的SDS-page的胶，80V跑2-3小时，200mA转膜3.5h，一抗用5%BSA稀释1:1000,4°孵育过夜，二抗1:2000牛奶稀释，孵育1小时，TBST洗膜三次，每次10分钟，结果膜上一点痕迹都没有，求助各位大侠，跑230kd的蛋白有什么技巧吗？

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转印液用的什么？转膜的条件200mA我们转两个小时做280 Kda的蛋白都没有问题。另外就是你的样本究竟表达多少了？Positive control有没有？

作者: whitesheep 时间: 2014-7-8 15:45

western的几个问题:
1. postive control
你是否确定你的样品里面有230kd的这个蛋白表达？比如说过表达的样品。我相信你没有。
你是否确定你的抗体是好的？比如过表达一个flag tag的，然后看flag能否杂出来。
确定之后再来做trouble shooting
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我做的是VEGFR，这个要怎么做阳性对照？这个是固定表达的吧？抗体是刚买没多久的CST的，应该没问题的。

作者: whitesheep 时间: 2014-7-8 15:48

转印液用的什么？转膜的条件200mA我们转两个小时做280 Kda的蛋白都没有问题。另外就是你的样本究竟表达多少了？Positive control有没有？

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我用的转膜液是1L体系里3.03gTris，14.4g甘氨酸，200mL甲醇，样本是2*loading抽提的，蛋白浓度还可以，Vegfr能做阳性对照吗？

作者: jujuba 时间: 2014-7-8 15:50

你整个WB流程是没有问题的,问题可以缩小为:
1,目的蛋白是否表达?
2,抗体是否工作?

作者: whitesheep 时间: 2014-7-8 15:51

我用的转膜液是1L体系里3.03gTris，14.4g甘氨酸，200mL甲醇，样本是2*loading抽提的，蛋白浓度还可以，Vegfr能做阳性对照吗？

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转膜缓冲液没有什么问题的。阳性对照的问题了

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