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标题: 【讨论帖】定量PCR实验技术分享（解答定量问题） [打印本页]

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 08:54 标题: 【讨论帖】定量PCR实验技术分享（解答定量问题）

本人做过几年的定量PCR，有一定的经验。看到版里头有许多战友对定量有许多问题。愿意就定量PCR的问题与各位战友一起探讨。

作者: bring 时间: 2014-7-27 08:55

请教一下
如果扩增曲线ct值比较靠后的话，32左右
一般有什么方法解决没有

作者: join 时间: 2014-7-27 08:55

QUOTE:

原帖由 bring 于 2014-7-27 08:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教一下
如果扩增曲线ct值比较靠后的话，32左右
一般有什么方法解决没有

ct值比较靠后，对实验有一定的影响，因为经过那么多次的循环，酶的活性有可能有所下降，这时候扩增效率会有所改变（而定量PCR的理论基础就是每次循环的扩增效率我们认为是确定的一个值）。因此最好能够把ct值往前移。
解决办法可以将模板加以浓缩或者抽干之后用少量水去溶解。

作者: standbyme 时间: 2014-7-27 08:56

请教: 为什么合成的引物做不加摸板的对照也能扩增出目的条带,而内参用同样体系就没有呢?是引物被污染还是引物设计不好导致的?

作者: zhenxin 时间: 2014-7-27 09:46 标题: 回复 #1 挖挖挖的帖子

请教：我做的目的基因的Ct值总在38－39左右，有什么好办法降低它的Ct值？（模板DNA是用20ul水溶解的，每次用8ul左右，浓缩的方法好像行不通）

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 09:46

请教: 为什么合成的引物做不加摸板的对照也能扩增出目的条带,而内参用同样体系就没有呢?是引物被污染还是引物设计不好导致的?

==========

引物被污染。

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 09:47

请教：我做的目的基因的Ct值总在38－39左右，有什么好办法降低它的Ct值？（模板DNA是用20ul水溶解的，每次用8ul左右，浓缩的方法好像行不通）

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是否可以将扩增曲线贴上来看看

作者: seagate 时间: 2014-7-27 09:47

请教：
实时定量PCR，荧光定量PCR，实时荧光定量PCR，real－time PCR，这些是不是同一个概念？

总是迷惑，多谢先！

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 09:48

QUOTE:

原帖由 seagate 于 2014-7-27 09:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教：
实时定量PCR，荧光定量PCR，实时荧光定量PCR，real－time PCR，这些是不是同一个概念？

总是迷惑，多谢先！

是一个意思。

作者: remonte 时间: 2014-7-27 09:49

real－time PCR 即定量PCR？

作者: XYZQ 时间: 2014-7-27 09:49

请教大侠！
对于定量数据分析及要求有不少疑问在论坛请教好多次（帖子地址：cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&amp');id=7149828&sty=1&tpg=3&age=0），可惜均无人答复，不知可否请大侠帮帮忙，我现在就等搞清楚这个问题好分析数据了。谢谢先

作者: vcve 时间: 2014-7-27 09:50

请教大侠，我的标准曲线的slope总是大于４，而且每个梯度的平行ct值差别比较大，这是是原因．请赐教．谢谢先了！

作者: eric930 时间: 2014-7-27 09:50

请教一下那个ROX染料是什么作用？
一直不知道

还有在融解曲线刚开始做的时候
样品会升到95度几秒钟
然后才从60度开始－－到90度
为什么要95度，而且此时的荧光值会突然大大增加？
见下图

作者: 蒲公英 时间: 2014-7-27 09:51

real－time PCR 即定量PCR？

======

是的

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 09:51

曾将PCr结果上传到论坛请教，园友认为曲线可（见：cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&amp');id=6916908&sty=1）
样本跑得差不多了，看试剂还多就把有些样本重跑了一次，发现两次的结果相差太大。
1。我用的看家基因作为内对照，进行相对定量（delta delta CT法），delta CT=（CT目的基因）—（CT看家基因), 通过统计比较病例组与正常组的delta CT，检测目的基因在病例组与正常组的表达差异
2。每个样本均有3个平行孔重复，即每样本的目的基因同时做3个，看家基因同时做3个，实验结果显示3个平行孔Ct值一致性很好，后来重复做的样本平行孔德一致性也好，就是两次间的差异太大，反应条件完全一样啊。
3。如果目的基因表达有变化，如降低，那么在统计时，病例组的delta CT是应该比正常组高还是低啊。
一头雾水，拜托赐教！！

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2、你是从RNA反转录开始做还是从cDNA开始做，如果从RNA开始做，可以考虑RNA是否被部分降解。如果从cDNA开始做，可能是样品被污染。
3、目的基因表达降低，那么目的基因的CT值将增大。病利组的delta CT应该比正常组的大。

作者: zhenxin 时间: 2014-7-27 09:52

请教大侠，我的标准曲线的slope总是大于４，而且每个梯度的平行ct值差别比较大，这是是原因．请赐教．谢谢先了！

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这个斜率是＝1/LOG 10(扩增效率)，理论上扩增效率＝2，斜率是3.322。如果斜率大于4，说明扩增效率比较小。可以考查一下反应体系是否合理？酶活是否正常？

平行管的CT值差别大可以考查一下自己实验操作是否规范，另外一种原因就是仪器本身的误差也可能会导致CT值差别比较大。

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 09:53

请教一下那个ROX染料是什么作用？
一直不知道

还有在融解曲线刚开始做的时候
样品会升到95度几秒钟
然后才从60度开始－－到90度
为什么要95度，而且此时的荧光值会突然大大增加？

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ROX的作用ABI宣称是用来校准加样误差的。
但是据说ROX的作用实际上是用来校准光程差的。即每个孔的荧光信号经过滤光片在经过聚焦到CCD的时候，走过的光程是不一样的，这样在CCD上成像的亮度就不一样了。所以需要把这个差异用ROX来计算孔间差异有多大，然后差异系数去处理，实际的荧光信号。具体过程我不是非常清楚，请高手指正。

不知道你从哪里看到需要先95度？图上的位置应该也不是95度。

作者: remonte 时间: 2014-7-27 09:54

还有个问题是，使用delta delta Ct方法相对定量时：
1。我将某一个标本的目的基因（3个重复孔）和看家基因（3个重复孔）一起跑，即目的基因和看家基因分管但同批跑，有说法是应该将标本的目的基因一批跑，再在另一批跑看家基因，即目的基因与看家基因分批跑，不知哪种正确
2。如果我只探讨表达的变化，而不计算病例组目的基因相对对照组的表达倍数，是否可以不用delta delta Ct 法，即不用考虑目的与看家扩增是否一致呢。直接统计两组delta Ct 差别有无统计学意义即可，可否？

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 09:54

QUOTE:

原帖由 remonte 于 2014-7-27 09:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
还有个问题是，使用delta delta Ct方法相对定量时：
1。我将某一个标本的目的基因（3个重复孔）和看家基因（3个重复孔）一起跑，即目的基因和看家基因分管但同批跑，有说法是应该将标本的目的基因一批跑，再在另一批跑看家基因，即目的基 ...

1. 应该在同一批跑比较好。这样可以消除仪器在两批之间的控制差异。当然这个必须保证目的基因与看家基因的运行程序是一样的时候。
2、没有意义。因为你不知道你加入的cDNA模板是否来自相同数目的细胞的RNA所反转录来的。做了看家基因之后即可以看到实验组和对照组中这个数目的比例。

作者: greenbee 时间: 2014-7-27 09:55

这个斜率是＝1/LOG 10(扩增效率)，理论上扩增效率＝2，斜率是3.322。如果斜率大于4，说明扩增效率比较小。可以考查一下反应体系是否合理？酶活是否正常？

平行管的CT值差别大可以考查一下自己实验操作是否规范，另外一种原因就是仪器本身的误差也可能会导致CT值差别比较大。

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当斜率为4的时候，扩增效率是77.8%，斜率大于4的话，效率继续下降。
扩增效率的问题实际就是引物的扩增效率，可能酶活的关系没有那么重要，前提是试剂盒的质量有保证。回到扩增效率，只有在引物和模板处于最适比例时才能得到比较满意的扩增效率，因此通过调节PCR反应体系中的引物终浓度来解决，可以做一些引物梯度来比较。

作者: JK.jon 时间: 2014-7-27 09:56

1. 应该在同一批跑比较好。这样可以消除仪器在两批之间的控制差异。当然这个必须保证目的基因与看家基因的运行程序是一样的时候。
2、没有意义。因为你不知道你加入的。做了看家基因之后即可以看到实验组和对照组中这个数目的比例。

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我说的delta Ct 指Ct（目的基因）-Ct（看家基因），这样不是就避免了“cDNA模板是否来自相同数目的细胞的RNA所反转录来的”这一问题吗？即delta Ct 是目的基因相对看家基因的值，然后比较病例组与对照组delta Ct的差异有无统计学意义（不用2-delta delta Ct 计算表达的相对倍数，我觉得非检验科的算出来没意义），这样不就可以说明两组表达有无变化吗？

作者: 大脑门儿儿 时间: 2014-7-27 16:03

ROX用来消除光程差，好像也有可能

不知道你从哪里看到需要先95度？图上的位置应该也不是95度。
这是我在程序运行的时候
instrument里面有个sample的温度，还有block的温度等信息
图上的位置为扩增45个循环后准备开始做融解曲线
此时sample 温度增为95度，持续10s
然后从60开始

还有几个问题，
Rn是什么意思
delta Rn又是什么，好像delta Rn的值是荧光量的lg值
还有，四个虑光片是什么作用
以哪个为准，总荧光和这又是什么关系

最近在用计算机程序模拟real-time的数据处理
不知道他是怎么通过检测的荧光值划出的扩增曲线
谢谢

作者: yapuyapu 时间: 2014-7-27 16:04

请问：
PCR效率的合理波动范围为？
谢谢！

作者: tie8 时间: 2014-7-27 16:05

请教：
荧光定量PCR的基线，是怎么确定的呢？初学者，望有较详细解析。谢谢大侠！

作者: viviwang1987 时间: 2014-7-27 16:06

您好！
我想请教你一下
DNA原始拷贝数的作用是什么呢
怎么通过它来建立与疾病的关系呢？
谢谢

作者: ha111 时间: 2014-7-27 16:06

请教：
荧光定量PCR的基线，是怎么确定的呢？初学者，望有较详细解析。谢谢大侠！
基线就是背景值，因此就是曲线在没有“起跳”之前的一段。在软件上有一个地方可以输入
baseline从第几到第几cycle作为基线。设置原则是使没有起跳之前最多的cycle的信号接近0。

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 16:07

您好！
我想请教你一下
DNA原始拷贝数的作用是什么呢
怎么通过它来建立与疾病的关系呢？
谢谢

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举个例子，可以测定血液中HBV DNA的拷贝数，这样就可以知道乙肝患者体内的HBV的浓度。
此外如果测定cDNA的时候，可以用来研究目的基因mRNA在正常样品和疾病样品中的表达差异，这样可以研究疾病与某个基因的关系。

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 16:08

ROX用来消除光程差，好像也有可能

不知道你从哪里看到需要先95度？图上的位置应该也不是95度。
这是我在程序运行的时候
instrument里面有个sample的温度，还有block的温度等信息
图上的位置为扩增45个循环后准备开始做融解曲线
此时sample 温度增为95度，持续10s
然后从60开始

还有几个问题，
Rn是什么意思
delta Rn又是什么，好像delta Rn的值是荧光量的lg值
还有，四个虑光片是什么作用
以哪个为准，总荧光和这又是什么关系

最近在用计算机程序模拟real-time的数据处理
不知道他是怎么通过检测的荧光值划出的扩增曲线
谢谢

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有些仪器在做溶解曲线之前推荐先加热到95度，是让产物完全解链之后，然后降到60度后再重新结合，这样让产物双链尽可能结合。
之所以荧光值会升高，其实不是在95度的时候升高，而是到了60度的时候测定的荧光值升高了。具体是因为在扩增的时候测定荧光值都是在72度延伸之后测定荧光的。因为60度比72度低，60度的时候双链结合更加完全，这时候结合了更多的SYB GREEN I.因此荧光曲线上升。

Rn是第n个循环的荧光值，delta Rn你说的是正确的。
四个率光片，每个滤光片让一种荧光染料发出的荧光通过。如果你想在一管里头同时检测四种不同的模板DNA的数量，这样就可以用四种荧光染料标记的探针（taqman探针）来检测。一种探针对应检测一个模板DNA。一般没有人关注总荧光量。

扩增曲线是在第n个循环72度扩增之后测定荧光值作为Rn。然后将每一个循环的数据点连接起来就是扩增曲线了。

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 16:08

xiang1x wrote:
请问：
PCR效率的合理波动范围为？
谢谢！

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这个具体的范围我还真不知道，应该没有一个明确的范围。但是越接近3。322说明扩增效率越接近2。

作者: 7437654 时间: 2014-7-27 16:10

谢谢指点
让我豁然开朗

那是不是sybr染料主要就是对应于b虑光片呢
分析主要用b虑光片的荧光值？

还有，用不同的试剂盒，作出来的Tm值有些会差距1度左右
请问这是怎么回事，产物应该是同一个
我用takara和普通的pcr试剂盒做出来是一样的
但是用理生的real试剂盒做出来是少1度的
觉得有些奇怪

作者: gogo 时间: 2014-7-27 16:11

我刚准备做定量，请教一下
　　１不知道伯乐的机子怎么样？
　　２请推荐几个合适的ＳＹＢＲ　ＧＲＥＥＮ的盒子，１０００以内的（没钱不好办啊），我大约做２０个样，谢谢
　　３现在对ＳＹＢＲ　ＧＲＥＥＮ认可吗？
预先谢谢！

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 16:11

谢谢指点
让我豁然开朗

那是不是sybr染料主要就是对应于b虑光片呢
分析主要用b虑光片的荧光值？

还有，用不同的试剂盒，作出来的Tm值有些会差距1度左右
请问这是怎么回事，产物应该是同一个
我用takara和普通的pcr试剂盒做出来是一样的
但是用理生的real试剂盒做出来是少1度的
觉得有些奇怪

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这位老兄好像做的很多是硬件方面的。不知道你用的是什么机型，俺也学学，毕竟我用的仪器也不多。那个滤光片，你可以看一下操作手册。

Tm值有一度的变化可能原因在于试剂盒的组成不同，离子浓度不同，对Tm有一定的影响。

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 16:12

我刚准备做定量，请教一下
　　１不知道伯乐的机子怎么样？
　　２请推荐几个合适的ＳＹＢＲ　ＧＲＥＥＮ的盒子，１０００以内的（没钱不好办啊），我大约做２０个样，谢谢
　　３现在对ＳＹＢＲ　ＧＲＥＥＮ认可吗？
预先谢谢！

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1、伯乐的机子不错。
2、takara的试剂盒，大概在1500元，400个反应。
3、大部分人做还是用sybr green I的。这是最常用的染料。

作者: zhenxin 时间: 2014-7-27 16:12

谢谢
一点即通啊

我的机型是ABI7000的，我不作硬件，只是好奇
多了解一些原理，可以更好的做实验

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 16:13

基线就是背景值，因此就是曲线在没有“起跳”之前的一段。在软件上有一个地方可以输入
baseline从第几到第几cycle作为基线。设置原则是使没有起跳之前最多的cycle的信号接近0。

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您好。先谢谢你。
不过，基线在软件上是可以自己手动拉的。很少有去设置具体的循环数。
因为在定量PCR中，基线的位置关系到CT值，而我对基线的定位却十分模糊，更本不知道怎么去确定基线的位置。所以请大侠能详细一点，或者能给个具体的例子吗？

作者: gogo 时间: 2014-7-27 16:13

恩，还有，大侠，再请教一个问题。
引物和探针对CT值有什么影响呢？
谢谢

作者: newway 时间: 2014-7-27 16:14

请问大侠，
1、扩增出来的曲线不光滑是怎么回事，应该怎样调整体系？
2、扩增的增益值有的高有的低，它主要与什么相关？
3、降低Ct值，除了加大浓度，还有什么需要改进的？

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 16:14

QUOTE:

原帖由 gogo 于 2014-7-27 16:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
恩，还有，大侠，再请教一个问题。
引物和探针对CT值有什么影响呢？
谢谢

首先要保证引物能够跟模板完全配对，
第二，引物应该是过量的。
第三，引物不应该形成引物二聚体。
也说白了就是要保证体系的扩增效率尽量地达到2并且没有非特异性扩增。在保证这个前提之下引物对CT值是没有影响的。
如果第一和第二没有达到，应该CT值会变大。如果第三没有达到那么CT值应该变小。

1探针应该与模板完全配对，并且有一定的长度，浓度过量。2。保证探针能够特异性地完全结合在模板上。

1没有满足CT值会变大。 2没有满足CT值可能变小。

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 16:15

QUOTE:

原帖由 newway 于 2014-7-27 16:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问大侠，
1、扩增出来的曲线不光滑是怎么回事，应该怎样调整体系？
2、扩增的增益值有的高有的低，它主要与什么相关？
3、降低Ct值，除了加大浓度，还有什么需要改进的？ ...

1、扩增曲线不光滑应该与体系关系不大（除非你的体系里头是浑浊的）。主要与操作和仪器本身及分析过程相关。
2、扩增的增益值（最终的荧光信号值），正常情况下与体系中的任何一个因素都有关，随着PCR产物的增加。那一种成分首先成为短缺资源，那么最终的荧光信号值主要与之有关。为什么基本上是相同的体系，最终的荧光信号值会不一样，这个我也没有想明白，估计可能和加样的体积误差有关？
3、在你的扩增效率已经非常接近2的时候，除了加大模板浓度之外目前没有其他有效方法。

作者: 小螺号 时间: 2014-7-27 16:15

您好。先谢谢你。
不过，基线在软件上是可以自己手动拉的。很少有去设置具体的循环数。
因为在定量PCR中，基线的位置关系到CT值，而我对基线的定位却十分模糊，更本不知道怎么去确定基线的位置。所以请大侠能详细一点，或者能给个具体的例子吗？

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不知道你用什么仪器？基线的设置我用过的都是输入数字的，手动拉的是thresthold。你是不是概念错了？基线的设置我上面应该说清楚了。

作者: 考拉乌拉拉 时间: 2014-7-27 16:16

请教：1. thresthold该怎样设置合理？根据Ct 值么？那Ct 值在多大范围内好呢？

2. 我要做的探针法，有几个目的基因要做，是每一个的扩增条件都不同么？

本人是新手，先谢谢拉！

作者: memory 时间: 2014-7-27 16:16

还请教一下：

如果每个扩增条件不一样，那每一批都要跑内参么？

作者: standbyme 时间: 2014-7-27 16:17

我还有一个疑问：定量的国际标准浓度是100000IU/ml，而所测的基因定量值是5×100000拷贝，它们之间的关系是什么？后者表示每ul有500000个拷贝，还是每ml有500000个拷贝？

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 16:34

QUOTE:

原帖由 考拉乌拉拉 于 2014-7-27 16:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教：1. thresthold该怎样设置合理？根据Ct 值么？那Ct 值在多大范围内好呢？

2. 我要做的探针法，有几个目的基因要做，是每一个的扩增条件都不同么？

本人是新手，先谢谢拉！ ...

thesthold的设置，
因为定量的基础是假设指数扩增期之前的扩增效率都是接近2的一个定值。所以设置thesthold一般设置在刚起跳不久，也就是比较接近于零的位置，软件有默认的thesthold，一般采用软件默认的就可以了。如果设得很高，这时候反应体系里头的一些资源已经处于短缺状态，扩增效率无法接近2。这时候就没有什么理论依据了。
一般采用探针法来定量模板数量的时候都是希望能在一个管里头来做多重反应，这样的反应条件比较一致，同时能减少实验操作。那么这时候的扩增条件主要是各对引物的TM值要保持一致，而且不要相互有配对的现象。当然扩增条件是一致的。

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 16:34

我还有一个疑问：定量的国际标准浓度是100000IU/ml，而所测的基因定量值是5×100000拷贝，它们之间的关系是什么？后者表示每ul有500000个拷贝，还是每ml有500000个拷贝？

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不是很明白你说的国际标准浓度是什么意思？你这个问题似乎是两个问题，1IU是怎么定义的？2、5×100000拷贝是什么意思？

有些药物如维生素、激素、抗生素、抗毒素类生物制品等，它们的化学成分不恒定或至今还不能用理化方法检定其质量规格，往往采用生物实验方法并与标准品加以比较来检定其效价。通过这种生物检定，具有一定生物效能的最小效价单元就叫”单位”（u）；经由国际协商规定出的标准单位，称为”国际单位”（IU）。国际标准品主要是供给各国来建立和标化自己的国家标准品。对于还没有建立国际标准品的药物可以由本国制订国家标准品。

5×100000拷贝应该是说一个反应体系中有这么多个分子，那么就看你加入多少ul的模板了，把5×100000除以你的模板体积就等于你的浓度啦。单位是拷贝/ul。

作者: gogo 时间: 2014-7-27 16:34

我还要请教一下：

1、我有4个目的基因要做，因为同源性较高，所以采用探针法。包括内参那

   就是5个基因了。我是不是每个目的基因都分管加啊，内参也要分开加?

2.  我用的是ABI7900HT,今天做了内参和一个目的基因预实验，跑了40个循环

   两者都没到平台期，扩增曲线光滑，起跳也在18－35之间,经过Delta Rn处

   理能看出S形，这样的数据行么？这样的条件能用么？后来，老师建议我

   跑55个cycle试试，可有人说55个也没用，到底怎么办捏？谢谢拉！

作者: redbutterfly 时间: 2014-7-27 16:35

我还想请教你一下标准品的问题。
我要用质粒标准品对我的目的基因定量，这属于相对定量还是绝对定量？还有质粒标准品的扩增条件和我要的目的基因的扩增条件不一样，这样推断出我的目的基因的拷贝数准确吗？
我是新手，很多概念都不是很清楚，问的问题可能很搞笑，请见谅。我看论坛上有些战友说的意思好像是标准品还要克隆到T载体上，完全被搞糊涂了，不知道使用标准品的具体步骤是什么，希望你也能给个详细的解答。谢谢。

作者: chuntian1983 时间: 2014-7-27 16:36

你好，我还想再请教你个问题，想了好久想不通。
我用试剂盒的话，可以将模板等比稀释5个梯度，但是自己配制的体系怎么都达不到5个梯度稀释，这到底是为什么？

作者: zbboom 时间: 2014-7-27 16:36

急急急！！！！请问能否用质粒DNA作为real-time RT-PCR的标准品呀？有必要将它转化到T载体上，挑克隆来制备吗？

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 16:37

QUOTE:

原帖由 zbboom 于 2014-7-27 16:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

急急急！！！！请问能否用质粒DNA作为real-time RT-PCR的标准品呀？有必要将它转化到T载体上，挑克隆来制备吗？

将目的基因插入质粒DNA中，然后转化到细菌中，扩增，再收集质粒，把这样的质粒作为标准品。
因为质粒比较容易知道它的分子量，那么通过测定OD值可以知道质粒的总质量，然后就可以知道质粒的真实的浓度了。

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 16:37

你好，我还想再请教你个问题，想了好久想不通。
我用试剂盒的话，可以将模板等比稀释5个梯度，但是自己配制的体系怎么都达不到5个梯度稀释，这到底是为什么？

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这个应该是必须你自己的分析。但是大致的方向应该是自己配制的反应体系扩增效果没有试剂盒好。
毕竟，试剂盒是人家多次实验研发优化出来的。你自己配置的体系先经过优化之后，应该也可以。

作者: 小螺号 时间: 2014-7-27 16:37

首先，谢谢你的回答！
按照您的说法，质粒DNA可以用做real-time RT-PCR的标准品吗？需不需要将目的基因插入质粒DNA中，然后转化到细菌中，扩增，再提取总的RNA（包括细菌和质粒的RNA），然后逆转录成cDNA, 把这样得到的cDNA作为标准品

作者: idea2011 时间: 2014-7-27 16:38

请问：做大规模临床患者血清某种成分的PCR，大约100人份，需要每人分别做么？大约需多少钱，您有没有比较经济可靠的方法可以推荐给我们。谢谢！

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 16:38

首先，谢谢你的回答！
按照您的说法，质粒DNA可以用做real-time RT-PCR的标准品吗？需不需要将目的基因插入质粒DNA中，然后转化到细菌中，扩增，再提取总的RNA（包括细菌和质粒的RNA），然后逆转录成cDNA, 把这样得到的cDNA作为标准品

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提取的是质粒DNA，而不是质粒RNA。直接拿质粒DNA来作为标准品。

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 16:39

请问：做大规模临床患者血清某种成分的PCR，大约100人份，需要每人分别做么？大约需多少钱，您有没有比较经济可靠的方法可以推荐给我们。谢谢！

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我不知道你是要知道每个人的血清中含有多少成分，还是只是需要知道这一批血清中是否被污染了？能否更加详细地说明一下你的实验目的？你说得多少钱是要我帮你推荐其他人帮你做的价格还是自己做的试剂成本？

作者: zbboom 时间: 2014-7-27 17:13

非常感谢您的帮助，我们想做冠心病患者血清中IL-6基因多态性，与正常人比较，需要约100例患者，我们想知道自己做大约需多少经费，因我们没有基础，想知道是否容易出结果，十分感谢！！

作者: yyaxw84 时间: 2014-7-27 17:19

请教质粒DNA的存在会不会干扰SYBR的荧光检测？我电泳条带中的质粒jiyinＤＮＡ如何去除？

作者: yyaxw84 时间: 2014-7-27 17:20

非常感谢您的帮助，我们想做冠心病患者血清中IL-6基因多态性，与正常人比较，需要约100例患者，我们想知道自己做大约需多少经费，因我们没有基础，想知道是否容易出结果，十分感谢！！

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请问你知道具体的位点吗？位点多吗？位点太多不适合 real time pcr。

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 17:20

请教质粒DNA的存在会不会干扰SYBR的荧光检测？我电泳条带中的质粒jiyinＤＮＡ如何去除？

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sybr是要嵌入双链DNA中才会发荧光的，所以如果模板浓度太大的时候，质粒DNA是会对检测有所影响的。但是正常情况，我们让扩增曲线在十几个循环之后起跳，也就是说要求模板浓度不要太高。所以正常实验，质粒DNA不会对SYBR的荧光检测造成影响。

你在电泳的时候，如果使用正常的质粒DNA模板的浓度，跑电泳的时候质粒DNA的条带不会出现，因为浓度太低。

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 17:21

QUOTE:

原帖由 yyaxw84 于 2014-7-27 17:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
非常感谢您的帮助，我们想做冠心病患者血清中IL-6基因多态性，与正常人比较，需要约100例患者，我们想知道自己做大约需多少经费，因我们没有基础，想知道是否容易出结果，十分感谢！！

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一百例就是稀释一百倍，一般试剂盒是能有这个灵敏度的，所以你可以把一百多个人的样本混合，要混合均匀，做成MINI POOL，而后检测MINI POOL就可以了。看不同产家的吧，价格不同。

作者: wanglaoshi 时间: 2014-7-27 17:21

我把模板做梯度稀释，为什么原始浓度的Ct值比1/10稀释的Ct值还低？

作者: xueyouzhang 时间: 2014-7-27 17:22

请问：大家谁熟悉上海久盛生物技术有限公司啊？该公司的试剂盒质量如何？谢谢！

作者: lagua123 时间: 2014-7-27 17:22

请问：大家谁熟悉上海久盛生物技术有限公司啊？该公司的试剂盒质量如何？谢谢！

作者: yapuyapu 时间: 2014-7-27 17:22

请问，我用质粒DNA做标准曲线，R^2值总是

作者: bring 时间: 2014-7-27 17:24

thesthold的设置，
因为定量的基础是假设指数扩增期之前的扩增效率都是接近2的一个定值。所以设置thesthold一般设置在刚起跳不久，也就是比较接近于零的位置，软件有默认的thesthold，一般采用软件默认的就可以了。如果设得很高，这时候反应体系里头的一些资源已经处于短缺状态，扩增效率无法接近2。这时候就没有什么理论依据了。

是不是手动设置有几条基本原则：基线盖过所有阴性曲线，基线尽量位置最低，尽量位于曲线拐弯处？
为什么据此原则设置的基线与软件默认的不同呢？哪个更准确些？
多谢指教！

作者: tie8 时间: 2014-7-27 17:24

我把模板做梯度稀释，为什么原始浓度的Ct值比1/10稀释的Ct值还低？

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我觉得这是一个优化过程，不是模板越多CT值越靠前的，模板浓度太高会有抑制作用，使得荧光探针不能充分结合。

作者: wood533 时间: 2014-7-27 17:29

请问：为了节省金费，本人用了25ul反应体系，但在软件输入反应条件时却忘了更改（50ul）不知对实验结果是否会有影响？
谢谢！

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 17:29

我觉得这是一个优化过程，不是模板越多CT值越靠前的，模板浓度太高会有抑制作用，使得荧光探针不能充分结合。

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可是我前段时间做过浓度更大的样品，它的1/10稀释比这个样品的原始浓度还大，跑出了很低的Ct值，所以按理论，这个样品应该能得出对应的Ct值啊。

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 17:30

可是我前段时间做过浓度更大的样品，它的1/10稀释比这个样品的原始浓度还大，跑出了很低的Ct值，所以按理论，这个样品应该能得出对应的Ct值啊。

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忘记问个问题，CT值低的意思是不是靠前，数值小

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 17:30

我把模板做梯度稀释，为什么原始浓度的Ct值比1/10稀释的Ct值还低？

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浓度越高，CT值本来就越小。

作者: ladyhuahua 时间: 2014-7-27 17:31

请问，我用质粒DNA做标准曲线，R^2值总是

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 17:31

请问：为了节省金费，本人用了25ul反应体系，但在软件输入反应条件时却忘了更改（50ul）不知对实验结果是否会有影响？
谢谢！

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问题应该不大，输入反应体系体积我个人认为是PCR仪用于计算控温的时候能够更加准确地测定反应体系中的温度。但是25ul和50ul之间产生的温度差别对结果影响应该不大。

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 17:31

thesthold的设置，
因为定量的基础是假设指数扩增期之前的扩增效率都是接近2的一个定值。所以设置thesthold一般设置在刚起跳不久，也就是比较接近于零的位置，软件有默认的thesthold，一般采用软件默认的就可以了。如果设得很高，这时候反应体系里头的一些资源已经处于短缺状态，扩增效率无法接近2。这时候就没有什么理论依据了。

   是不是手动设置有几条基本原则：基线盖过所有阴性曲线，基线尽量位置最低，尽量位于曲线拐弯处？
   为什么据此原则设置的基线与软件默认的不同呢？哪个更准确些？
   多谢指教！

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thesthold和基线是两个概念，注意区别。

指数扩增期有一段区间，这段区间内你都可以认为它的扩增效率都是一样的，所以thesthold只要设置不是太高，都是有理论依据的。

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 17:32

我把模板做梯度稀释，为什么原始浓度的Ct值比1/10稀释的Ct值还低？

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这个的意思是原始浓度的Ct值数值比1/10稀释的大

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 17:32

可是我前段时间做过浓度更大的样品，它的1/10稀释比这个样品的原始浓度还大，跑出了很低的Ct值，所以按理论，这个样品应该能得出对应的Ct值啊。

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这个“很低的Ct值”是指数值低
不好意思，我把它们弄混了

作者: fei1226com 时间: 2014-7-27 17:33

我是在别的实验是做的，没有拷到SDS软件的，只拷回了扩增曲线，没有融解曲线。请您看看这个扩增曲线图。 PCR产物是161bp

作者: lagua123 时间: 2014-7-27 17:33

我是一个新手，我们实验室没有做定量的仪器，是去别的实验室做的。那个实验室软件没有备份，所以我没有找到SDS软件（仪器是ABI7900HT）。请教各位，最后我要拷回什么一些数据或图来分析啊？没有找到SDS软件（仪器是ABI7900HT）。这次我只是把各个反映管的CT值，扩增曲线图，标准曲线图拷回来了。谢谢！

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 17:33

QUOTE:

原帖由 fei1226com 于 2014-7-27 17:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我是在别的实验是做的，没有拷到SDS软件的，只拷回了扩增曲线，没有融解曲线。请您看看这个扩增曲线图。 PCR产物是161bp

请贴上Rn Vs Cycle的曲线，这样看起来方便一些。

作者: ladyhuahua 时间: 2014-7-27 17:34

帮我看看我的图图吧以前的还可以总是觉得不理想所以重新设计了引物，谁知道却是这个样子的，急啊愁啊我用的是SYBER GREEN I 用的是strategene的仪器，做的是半定量一步法直接用的RNA做的模板。

作者: utt0989 时间: 2014-7-27 17:36

请教各位：
我想做真菌定量PCR，那标准曲线的需要的真菌菌液有标准品吗？需要自己配制吗？比浊法怎么做？谢谢

作者: wzqzy 时间: 2014-7-27 17:37

Rn Vs Cycle的曲线是不是就是△Rn VS Cycle 图啊？

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delta Rn是Rn取log 10。有没有Rn对cycle的曲线

作者: ROSE李 时间: 2014-7-27 17:38

请教各位：
我想做真菌定量PCR，那标准曲线的需要的真菌菌液有标准品吗？需要自己配制吗？比浊法怎么做？谢谢

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定量PCR只是定量真菌中的某一个基因的，你把这个基因扩增出来之后，构建到质粒中，然后将质粒转化到E.COLI中，扩增细菌，就扩增质粒，然后抽提质粒，对质粒用OD260测定浓度，OD与质量浓度之间可以相互转换，这样就可以知道质粒的质量了，质粒的分子量是已知的，这样就可以知道质粒的摩尔浓度，也就是可以知道一定体积中有多少个质粒了。这就是标准品。具体中间的过程请自己查阅相关的基础知识。

作者: zhenxin 时间: 2014-7-27 17:38

帮我看看我的图图吧以前的还可以总是觉得不理想所以重新设计了引物，谁知道却是这个样子的，急啊愁啊我用的是SYBER GREEN I 用的是strategene的仪器，做的是半定量一步法直接用的RNA做的模板。

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问题应该出在引物上吧，第一，有引物二聚体，第二，感觉PCR产物不是很纯，有非特异性扩增，不知道有没有将定量PCR产物拿来跑过电泳，是否有非特异性的条带？请记住，引物设计好之后一定要拿到NCBI上去BLAST一下，看是否会与其他基因比较相似，最好的是只有与你的目的基因完全配对，与其他基因差别比较大。这样不会产生非特异性扩增。

作者: tie8 时间: 2014-7-27 17:39

首先谢谢你的回答我的引物是刚刚设计的，BLAST后效果很好的，这条引物是从牛津大学的引物库中引用的，应该信得过，另外我做了电泳，目的基因142bp没有出来，倒是出来了两条非特异带,内参基因还可以，就是融解曲线不行，咋办？如何继续摸索呢，提高退火温度吗那内参咋办呢以前做的内参就是这个退火温度，效果要比这个好的多，不知道为何，现在融解曲线不能用了

作者: bluelake 时间: 2014-7-27 17:39

我做荧光定量PCR已经快半年了，但是有一个问题一直无法解决，望大虾指教，多谢。问题是：标准品是qiagen试剂盒提的质粒，紫外分光光度仪进行核酸定量，计算出拷贝数/ul，然后10倍倍比稀释，从10*8~10*1/ul作为各梯度的标准品。
反映体系20ul，模板2ul。10*3、10*2、10*1及阴性对照，曲线几乎重合，无法分开。10*8~10*4的线性关系都很好，r值为1.7。
方法尝试过taqman和SYBR GREEN，都没法解决这个问题。
问题可能出在哪里？先谢谢了。

作者: seagate 时间: 2014-7-27 17:45

大侠：我现在正做荧光定量PCR，想请教几个问题
1。我以表达某个基因阴性的细胞序列稀释表达阳性的细胞，抽提RNA、RT、real-time PCR,怎样才能确定检测的敏感度呢？要不要做统计？
2。内参的该怎样选择？有必要同时做内参的标准曲线吗？

谢谢！

作者: kewanqi2011 时间: 2014-7-27 17:45

请问：
      我所用的ABI7300，一次可以做96个标本，用它公司配套的96孔板，上面是贴膜的。
      我的标本理论上讲CT值不同，可是结果却差不多，当时我怀疑是不是系统反应时标本与标本之间混合了（因为是贴膜的），可老师说如果是混合了，荧光也显示混合。
      请教高手出现此现象的原因，谢谢！！

作者: wanglaoshi 时间: 2014-7-27 17:45

请教引物的问题，谢谢解答！
我做的细菌是放线菌，粘性放线菌和内氏放线菌是我们实验室做的最多的，因此有标准菌，但是我的实验中还包括一些其他种类的放线菌，实验室里面并没有标准菌，我在genebank上下载到了这些放线菌的基因序列，并设计出来了引物，本来应该用标准菌检测一下引物的特异性的，但是如前面所述，没有标准菌，请问还有没有方法可以检查引物的特异性，比如在pubmed上有blast打分，能不能检测特异性，会不会得到公认？万分感谢！

作者: ladyhuahua 时间: 2014-7-27 17:47

sybgren做 real time 如溶解曲线和电泳结果好。能否不用加延伸温度（>非特异物TM小于产物）?

加了那个延伸温度,并不一定能把sybgreen 1 的溶解曲线的双峰变为单峰?

条件优化与加了那个延伸温度,比那个效果更好

作者: yyaxw84 时间: 2014-7-27 17:47

急急！

请问：
我所用的ABI7300，一次可以做96个标本，用它公司配套的96孔板，上面是贴膜的。
我的标本理论上讲CT值不同，可是结果却差不多，当时我怀疑是不是系统反应时标本与标本之间混合了（因为是贴膜的），可老师说如果是混合了，荧光也显示混合。
请教高手出现此现象的原因，谢谢！！

作者: standbyme 时间: 2014-7-27 17:48

首先谢谢你的回答我的引物是刚刚设计的，BLAST后效果很好的，这条引物是从牛津大学的引物库中引用的，应该信得过，另外我做了电泳，目的基因142bp没有出来，倒是出来了两条非特异带,内参基因还可以，就是融解曲线不行，咋办？如何继续摸索呢，提高退火温度吗那内参咋办呢以前做的内参就是这个退火温度，效果要比这个好的多，不知道为何，现在融解曲线不能用了

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你的扩增产物目的条带没有出来，我想提高退火温度还是出不来的。所以我感觉还是出现在引物这个环节上。

作者: standbyme 时间: 2014-7-27 17:48

我做荧光定量PCR已经快半年了，但是有一个问题一直无法解决，望大虾指教，多谢。问题是：标准品是qiagen试剂盒提的质粒，紫外分光光度仪进行核酸定量，计算出拷贝数/ul，然后10倍倍比稀释，从10*8~10*1/ul作为各梯度的标准品。
反映体系20ul，模板2ul。10*3、10*2、10*1及阴性对照，曲线几乎重合，无法分开。10*8~10*4的线性关系都很好，r值为1.7。
方法尝试过taqman和SYBR GREEN，都没法解决这个问题。
问题可能出在哪里？先谢谢了。

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每个仪器都有一定的检测限，不知道是不是你这个仪器的检测限比较差一些。建议你问一下仪器厂商的技术支持。

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 17:49

大侠：我现在正做荧光定量PCR，想请教几个问题
1。我以表达某个基因阴性的细胞序列稀释表达阳性的细胞，抽提RNA、RT、real-time PCR,怎样才能确定检测的敏感度呢？要不要做统计？
2。内参的该怎样选择？有必要同时做内参的标准曲线吗？

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谢谢！
第1个问题不是很明白，请重述。
2内参基因是选择一些在细胞中表达比较稳定，且表达丰度比较高的基因作为内参基因。比如beta actin。

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 17:49

请教引物的问题，谢谢解答！
我做的细菌是放线菌，粘性放线菌和内氏放线菌是我们实验室做的最多的，因此有标准菌，但是我的实验中还包括一些其他种类的放线菌，实验室里面并没有标准菌，我在genebank上下载到了这些放线菌的基因序列，并设计出来了引物，本来应该用标准菌检测一下引物的特异性的，但是如前面所述，没有标准菌，请问还有没有方法可以检查引物的特异性，比如在pubmed上有blast打分，能不能检测特异性，会不会得到公认？万分感谢！

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引物设计最后应该blast一下。你想确认一下特异性，除了BLAST，还可以用你的非标准菌直接用PCR扩增，然后跑电泳看看是否有非特异性条带。建议两者结合一下。

作者: 二丫头466 时间: 2014-7-27 17:50

求助战友,我遇到一个难题,年初设计的试验到做的时候才发现试剂盒买不到,求助各位战友,谁知道国内外哪家试剂公司生产MDR1(肿瘤多药耐药基因)的荧光定量PCR的试剂.

作者: yapuyapu 时间: 2014-7-27 17:50

我是用sybgren 1 做 real time ,因为sybgren是非特异结合双链,所以一般要在最后加上一个延伸温度（大于非特异物TM而小于产物的TM温度）?

以使非特异的小片段解链.

但我现在做的溶解曲线和电泳的结果都很好,没有见杂带,能否省去这步?

另外还想问一下:加了那个延伸温度一定能把非特异物在sybgreen 1 的溶解曲线上产生的峰去掉??如图上的黑圈
条件优化与加了那个延伸温度比哪个效果更好

作者: 六个梦 时间: 2014-7-27 17:51

每个仪器都有一定的检测限，不知道是不是你这个仪器的检测限比较差一些。建议你问一下仪器厂商的技术支持。

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我做荧光定量PCR已经快半年了，但是有一个问题一直无法解决，望大虾指教，多谢。问题是：标准品是qiagen试剂盒提的质粒，紫外分光光度仪进行核酸定量，计算出拷贝数/ul，然后10倍倍比稀释，从10*8~10*1/ul作为各梯度的标准品。
反映体系20ul，模板2ul。10*3、10*2、10*1及阴性对照，曲线几乎重合，无法分开。10*8~10*4的线性关系都很好，r值为1.7。
方法尝试过taqman和SYBR GREEN，都没法解决这个问题。
问题可能出在哪里？先谢谢了。

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您好，我也遇到了和an1212战友相似的问题，10*4Ct值只有28左右，后面再稀释就不出现起跳了。我的机子可以检测到35个循环以上。请问这是什么原因？

作者: u234 时间: 2014-7-27 17:52

你好，有个困扰我的问题想问下．
我用Ｔaqman探针，阴性（空体系）上机时也会出现很好的扩增曲线，大约８个里总会长１～２个，这应该不是试剂污染，可能是什么原因呢？
还有，
有时做灵敏度测定，空体系有扩增，而低浓度反而不长，实在很怪．

盼解答！

作者: zhenxin 时间: 2014-7-27 17:52

请教引物的问题，谢谢解答！

我做的细菌是放线菌，粘性放线菌和内氏放线菌是我们实验室做的最多的，因此有标准菌，但是我的实验中还包括一些其他种类的放线菌，实验室里面并没有标准菌，我在genebank上下载到了这些放线菌的基因序列，并设计出来了引物，本来应该用标准菌检测一下引物的特异性的，但是如前面所述，没有标准菌，请问还有没有方法可以检查引物的特异性，比如在pubmed上有blast打分，能不能检测特异性，会不会得到公认？万分感谢！

引物设计最后应该blast一下。你想确认一下特异性，除了BLAST，还可以用你的非标准菌直接用PCR扩增，然后跑电泳看看是否有非特异性条带。建议两者结合一下。

万分感谢您的回答，我的引物BLAST,特异性还可以，跑出的条带也很好，没有特异性条带，且与预计扩增的长度大小相一致，只是如果我这样写文章，要投国外的杂志，就是不晓得能不能得到国外同行的认可，多谢您再次的解答！

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 17:53

你好，有个困扰我的问题想问下．

我用Ｔaqman探针，阴性（空体系）上机时也会出现很好的扩增曲线，大约８个里总会长１～２个，这应该不是试剂污染，可能是什么原因呢？

还有，
有时做灵敏度测定，空体系有扩增，而低浓度反而不长，实在很怪．

盼解答！

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应该是污染，但应该不是试剂污染，而很有可能是你的仪器上有PCR产物，在运行的时候会产生气融胶，跑到管子中去，建议和仪器厂商的联系，看怎么清洗一下仪器。还有可能是你在操作过程中是否会操作不当，带入一些模板到阴性管中去呢？

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 17:53

我是用sybgren 1 做 real time ,因为sybgren是非特异结合双链,所以一般要在最后加上一个延伸温度（大于非特异物TM而小于产物的TM温度）?
以使非特异的小片段解链.

但我现在做的溶解曲线和电泳的结果都很好,没有见杂带,能否省去这步?

另外还想问一下:加了那个延伸温度一定能把非特异物在sybgreen 1 的溶解曲线上产生的峰去掉??如图上的黑圈
条件优化与加了那个延伸温度比哪个效果更好

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你的融解曲线没有问题，那些小峰是正常的。
大于非特异物TM而小于产物的TM温度，这一步是加在延伸后，读板之前的一步。作用就是你说的将非特异性产物解链。只要你没有非特异性的产物，可以省去你说的那一步。

作者: memory 时间: 2014-7-27 17:54

每个仪器都有一定的检测限，不知道是不是你这个仪器的检测限比较差一些。建议你问一下仪器厂商的技术支持。

我用的仪器是ROCHE 的lightcycler2.0，应该不会存在仪器检测限的问题，问过ROCHE公司的人，他们能做到几个拷贝，只是他们的试剂太贵，是不是我们的反应体系不够优化，我的实验低浓度包括阴性对照也能扩增出很好的曲线，基本和10*4曲线是重合的，难道是污染么？？
可是换了实验室，引物，反应体系，结果仍是如此，真的是污染的话，是什么污染了呢？？

作者: bring 时间: 2014-7-27 18:01

今天作荧光定量pcr，望大虾帮忙分析一下。
实验过程中更换SYBR GREEN，其他反应体系均未发生任何改变，更换后不能扩增，无任何峰值，更换前曲线很好，这又是什么原因阿？？

作者: dreaming 时间: 2014-7-27 20:40

你好，我正准备做定量PCR，mRNA 表达量分析。关于相对定量的标准曲线有点不明白，我查资料说可以用TOtal RNA 梯度稀释直接做标准品，做标准曲线，这样做的标准曲线也不知道确切RNA浓度，为什么不直接用Ct值比较呢，它们不是有线性关系吗？这样就不用做标准曲线，省很多事吗

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 20:48

QUOTE:

原帖由 bring 于 2014-7-27 18:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
今天作荧光定量pcr，望大虾帮忙分析一下。
实验过程中更换SYBR GREEN，其他反应体系均未发生任何改变，更换后不能扩增，无任何峰值，更换前曲线很好，这又是什么原因阿？？ ...

把PCR产物拿来跑一下电泳，如果有条带，那么很有可能是SYBR green 出了问题。如果没有条带，则要考查其他反应体系，或者程序是否有问题。

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 20:48

每个仪器都有一定的检测限，不知道是不是你这个仪器的检测限比较差一些。建议你问一下仪器厂商的技术支持。

我用的仪器是ROCHE 的lightcycler2.0，应该不会存在仪器检测限的问题，问过ROCHE公司的人，他们能做到几个拷贝，只是他们的试剂太贵，是不是我们的反应体系不够优化，我的实验低浓度包括阴性对照也能扩增出很好的曲线，基本和10*4曲线是重合的，难道是污染么？？
可是换了实验室，引物，反应体系，结果仍是如此，真的是污染的话，是什么污染了呢？？

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这样看来你的实验更象是污染了。有些时候你可以考虑一下是否仪器有污染，比如你将PCR产物不小心弄到仪器的反应腔中，这样每次做实验的时候，会产生气溶胶，污染你的反应。看看仪器擦洗之后是否会好一些。

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 20:49

你好，我正准备做定量PCR，mRNA 表达量分析。关于相对定量的标准曲线有点不明白，我查资料说可以用TOtal RNA 梯度稀释直接做标准品，做标准曲线，这样做的标准曲线也不知道确切RNA浓度，为什么不直接用Ct值比较呢，它们不是有线性关系吗？这样就不用做标准曲线，省很多事吗

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虽然不知道确切的RNA的浓度，但是做出标准曲线之后可以计算出扩增效率。通常情况下，是将扩增效率默认为2的时候来计算表达的相对倍数的。这样多少存在一些误差。通过标准曲线能够计算出实际的扩增效率。

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-27 20:53

请帮帮看看这个，我的R^2值总是上不去，是怎么回事啊。

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有没有可能污染？
我看你标准曲线的基本上是最低浓度的那个点偏离标准曲线，如果你把最低浓度的那个点删除掉，应该还是比较正常的。
有一种可能就是体系污染了，比如都污染了10e+3个拷贝，那么如果你加入模板量是10e＋3，这是候CT值就会比正常的少1，如果你加入模板量为10e＋4,那么这是候ct值只比正常值少一点点，如果你加入10e＋5，那么这时候对ct值已经没有影响了。也就是说模板浓度越低的时候，受污染之后产生的误差越大！。所以我感觉你的实验可能受到了污染，导致你的标准曲线中低浓度那一点偏离了标准曲线，这样你的整个R2值就变低了。

作者: tudou85 时间: 2014-7-27 20:53

我制标准曲线出现了一些难解的问题。当我把我的标准品等比例稀释（10倍稀释）后，只能跑到Ct值为28的那个浓度，此时标准品拷贝数为10000，再往下面稀释就没有起跳了，重复了几次都是这样。在这台机子上用其它标本也能做出Ct值为32、35的。请问出现上面的情况是什么原因？

作者: jiushikeshui371 时间: 2014-7-27 21:04

我想请教一下，我的阴性对照老是在32－34个循环出现条带，怎么克服？？还有标准品的稀释梯度也不是很好，试了几次都不是严格按照梯度来，请问如何解决

作者: ladyhuahua 时间: 2014-7-27 21:04

你好!
   我想做标准曲线法的相对定量,
   请问有没这种方法的具体操作手册和相关的文献资料.
   另外,我对标准曲线法的相对定量英文表述还不清楚,所以不方便进行相关搜索.
请大虾指点
谢谢

作者: yjf1026 时间: 2014-7-27 21:06

新手来的，想请教您啊，
我每组有10个样本，是不是每个都要做RT-PCR？
之后要不要统计呢？
一共有50 个样本，买什么试剂和比较好呢？
还有定量PCR是不是可以取代RT-PCR？
是不是只要做定量的就一定比RT-PCR好？

谢谢你！！

作者: wzqzy 时间: 2014-7-27 21:06

我想做半定量RT-PCR,但不知道试剂盒的情况,能给我提供一些参考吗?国产的也可以

作者: tianmei001 时间: 2014-7-27 22:36

我是用delta ct 的方法进行半定量的比较。
现在主要的问题是，我要总结我的结果，做excel表格。但是如何表示我的结果呢？直接比较delta ct，还是用2 为底数算出真实的拷贝数相差量？我看文献上都用arbituary unit 做纵坐标，到底是什么意思。麻烦你了，我就差最后一口气。谢谢！

作者: memory 时间: 2014-7-27 22:36

为何聚丙烯跑出条带，而琼脂糖无。且有时扩增曲线无结果，但电泳又有结果

我的片断是90BP，是否因为片断太小了呢？
另外有时候电泳有结果，但无扩增的S曲线。为什么啊

作者: skytree 时间: 2014-7-27 22:47

请帮忙分析一下，我现在开始做REALtime，现在有两家公司的产品让我试用，同一台机器，同样的模版和反应体系，反应条件，结果感觉B公司的看着更舒服一些，但是结果处理上两个公司的没有太大差异，请教：为何A的基线如此不整齐呢？

作者: veiwu 时间: 2014-7-27 22:48

我是做Real -time pcr的新手,我想问一下,溶解曲线是用来干什么的?还有,溶解曲线应该怎么做啊?有没有具体步骤啊?能不能发给我啊?

作者: any333 时间: 2014-7-27 22:49

我的标准曲线，R2只有0.90。slope只有2.7

梯度为 5×10的10次方，9次方，8次方，7次方，6次方

请问是那里出问题了？

作者: uaubc 时间: 2014-7-27 22:49

请教：
我刚准备做多重荧光定量PCR，请教楼主，实验中如何确定分组？应该考虑哪些因素呢？反应体系和反应条件与单重定量PCR相比，有哪些需要注意的地方吗？谢谢！

作者: redbutterfly 时间: 2014-7-27 22:50

求助:
用质粒做标准品,测了浓度,但没有质粒的全序列或分子量,无法算出分子拷贝数.pGEM-Teasy.

作者: wood533 时间: 2014-7-27 22:50

我用的是ABI公司，PRISM7000型机器。
染料是SYBR green I
体系是：
sybr mix 12.5 ul
primer1(20uM) 1ul
primer2(20uM) 1ul
DNA 5ul
H2O 6.5ul

Amplification曲线和Componet曲线都有,就是融解曲线(Dissociation)没有,不知道是何原因??
谢谢!!

作者: dog002 时间: 2014-7-28 17:21

请问，不加模板也能批出扩增曲线的情况，一定是引物被污染了吗？

我原来用生工的，现在换了takara的，还是不行，怎么办呢？

作者: jkobn 时间: 2014-7-28 17:22

1/伯乐的机子不错。
2、takara的试剂盒，大概在1500元，400个反应。
3、大部分人做还是用sybr green I的。这是最常用的染料。

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2、takara的试剂盒，大概在1500元，400个反应。
请问具体是什么试剂盒啊，我看了Takara的网站好像没有这么便宜的啊？
● Real Time PCR 相关制品下载说明书
  Perfect Real Time系列产品
SYBR甈remix Ex TaqTM (Perfect Real Time)

Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time)
ExScriptTM RT reagent Kit (Perfect Real Time)
SYBR瓻xScriptTM RT-PCR Kit (Perfect Real Time)
ExScriptTM RT-PCR Kit (Perfect Real Time)
EASY Dilution (for Real Time PCR )
One Step SYBR

作者: utt0989 时间: 2014-7-28 17:23

求助
Osteocalcin 和 Type I collagen的real time引物序列和探针序列
在文献中搜索了很多序列，但是在pubmed里blast后总显示没有相关性，这是为虾米捏？***各位大侠相助！！
以下是我搜的引物序列：
Alkaline phosphatase:
1.
forward 5‘cct cgt tga cac ctg gaa gag3’,
reverse 5‘ttc cgt gcg gtt cca gac3’,
probe ttc aaa ccg aga tac aag cac tcc cac ttc
2
forwardf 5_-AGCAAAGGTGCAGCCTTTGT-3_
reverse 5_-GCGCCTGGGTCTCTTCACT-3_
probe 5_-CCTCGCTGCCCTCCTGCTTGG-3_

Type I collagen
5‘AAGGTCATGCTGGTCTTGCT 3’ 5‘GACCCTGTTCACCTTTTCCA 3’

作者: yes4 时间: 2014-7-28 17:23

有没有人做过自身淬灭探针荧光定量PCR啊？

作者: redbutterfly 时间: 2014-7-28 17:23

自身淬灭探针荧光定量PCR的重复性好吗？
一对引物的浓度一定得非常一致吗?如做PCR时两者浓度稍有差异，如一个10pmol/l,一个13pmol/l,那会使原本很好得扩增曲线变得很糟吗？

作者: avi317 时间: 2014-7-28 17:24

求教：
1、RT-PCR用10ul做的话可以么？一般说最少要20ul体系，为什么？有什么区别？
2、为什么长片段不能（〉500bp）不能做SYBR GREEN？
万分感谢！

作者: qqq111 时间: 2014-7-28 17:24

请教大虾,我用ABI7000做的SYBR GREEN相对定量,可是我怎么发现我的分析软件上的溶解曲线的那个按键是灰的啊,怎么看不了溶解曲线呢?是不是对机器上保留的以前的结果在重新分析时都不能看到溶解曲线啊,请指教!!谢了!!

作者: qqq111 时间: 2014-7-28 17:25

不能粘图片,抱歉,在第一页中,纵坐标为deltaRn,横坐标为cycle number的那个图中, 图中的那条绿色的横线代表什么啊?多谢啊//

作者: nut6694 时间: 2014-7-28 17:25

请问如何设计试验确定反应体系的循环数呢?

作者: fei1226com 时间: 2014-7-28 17:25

我做实时荧光定量。用染料有非特异性条带，就重新设计探针引物。现在到30几个循环后才出来。别人说是模版浓度不够。不过染料都行，探针怎么不行呢？不明白。PCR混合缓冲液做染料时是买的，探针时是自己配的是不是酶不好使啊。

作者: c86v 时间: 2014-7-28 17:26

想请教做实时PCR内参的问题，我想用18s做内参，不过国内都很少做，这是为什么啊，我看到国外关于内参评价，18s是最好的啊。还有我在外文文献上查到引物和配套探针，可以直接用还是需要自己设计啊。非常感谢

作者: yhz1973 时间: 2014-7-28 17:26

请问用Taqman探针和不用Taqman探针时，引物能一样吗。

作者: DONT 时间: 2014-7-28 17:27

请问您,您知道哪个公司可以为客户做荧光定量PCR实验吗?我时间太紧张,今年要毕业,以前没做过分子方面的东东,想找个公司做一下。先谢谢了！！

作者: #甜# 时间: 2014-7-28 17:27

请教一下,做实时荧光定量RT-PCR是不是每测一个指标就要有一个标准曲线?

作者: #甜# 时间: 2014-7-28 17:28

还有,替朋友请教一下,他的实时荧光定量RT-PCR是找人代做的,为什么最后的图形线条很少啊?感谢高人指点

作者: youyou99 时间: 2014-7-28 17:28

定量和半定量有什么区别?

作者: 羊咩咩 时间: 2014-7-28 17:28

结果中那么多曲线怎么知道哪一个是实验组哪一个是对照组的?

作者: 阿司匹林 时间: 2014-7-28 17:29

如果做质粒标准品的话　　找的基因只能是单拷贝的啊．如果找的是多拷贝基因，细胞标准品怎么做啊

作者: bongte 时间: 2014-7-28 17:29

大侠.你好:
   我是做荧光定量PCR的新手,现在刚刚扩增得到我需要的一段序列并用Primer express2在这段序列中设计引物和探针.通过与近源生物序列的比对,发现序列600~700bp处特异性比较高.故我在此处设计了引物和探针.序列以及设计的引物探针如下:
目的基因序列:
      1 tgcgaaggct cattaaatca gctatggttc cttagatcgt aaacgctaca tggataactg
      61 tagtaatttt agagctaata catgccttga atccctgacc cgcaagggga cgggtgcatt
   121 tattagaaca gaaccaaccg ggtgcggctt atgctgtgcc tgttacattc tgtgatgact
   181 ctggataact ttactgatcg cagtcggcct tgtgtgtcgg cgacggatct ttcaaatgtc
   241 tgccctatca atttgttggt aggtgatttg cctaccatga tgataacggg taacggggaa
   301 tcagggttcg attccggaga gggagcctga gaaatggcta ccacatccaa ggacggcagc
   361 aggcgcgaaa attacccact cccagcacgg ggaggtagtg acgaaaaata cggatacggg
   421 actcaattga ggctccgtaa ttcgaatgag tacaatttaa atcctttaac gaggaccaat
   481 tggagggcaa gtctggtgcc agcagccgcg gtaactccag ctccaaaagc gtatattaaa
   541 gttgctgcag ttaaaaagct cgtagttgga tctgggtagt gcgatcgcat gctgttgctt
   601 gttcacggtc ttggttacga tcagggcagt ggtcagctcg gcgtagtggt tgtgcaacct
   661 ttcagccgtg tctgtgtttt attaaacagg tgtcgatggg ttaatgagta ttgtatctta
   721 ttgacctgtt ggcatgcttt cggatgcctt taaacgggtg tcgggggcgg acggcatctt
   781 tactttgaac aaatttgagt gctcaaagca ggcctatgcg cctgaaaatt cttgcatgga
   841 ataatgaaat aggacttcgg ttctattttg ttggttttcg gatccgaagt aatggttaag
   901 agggacagac gggggcattt gtatggcggt gttagaggtg aaattctggg atcgccgcca
   961 gacaaactac agcgaaagca tttgccaaga atgttttcat tgatcaggag cgaaagtcag
   1021 agtttcgaag acgatcagat accgtcgtag ttctgaccat aaacgatgcc aactgacgat
   1081 ccgcgttggt tctataattg acatcgcggg cagtccccgg gaaaccttta agtctttggg
   1141 ctccgggggg agtatggttg caaagctgaa acttaaagga attgacggaa gggcaccacc
   1201 aggagtggag cctgcggttt aattcgactc aacacgggaa aactcacccg gcccggacac
   1261 tgtgaggatt gacagattga aagctctttc ttgattcggt ggttggtggt gcatggccgt
   1321 tcttagttgg tggagcgatt tgtctggtta attccgataa cgaacgagac tttaacctac
   1381 taaatagtag actggtcctc tgtgctcgtt cagggcgcgg cttctactgc ttctttatgg
   1441 agtagtgtgg tcgtgatccg acgggtgcgg tgccagtttt tacttcttag agggacaagc
   1501 ggcacactta agtcgcacga aattgagcaa taacaggtct gtgatgccct tagatgtccg
   1561 gggccacacg tgcgctacaa tgacggtgcc agcgagcctg gaaacctggc ccgaaagggt
   1621 tgggcaaact gtttcatcac cgtcgtgact gggatcgggg cttgcaatta ttccccgtga
   1681 acgaggaatt cctggtaagt gcaagtcata agcttgcgct gattacgtcc ctgccctttg
   1741 tacacaccgc ccgtcgctac taccgattga atggtttagt gaggtcgttg gattggtgtc
   1801 gttgtagtgg ctttatcgct gctcgactga tatcgagaag acgacctaat ttgactattt
   1861 agaggaagta aaagtcgtac aga
引物和探针:
Name:    rDNA.txt-600F
Sequence:  TGTTCACGGTCTTGGTTACGAT
Name:    rDNA.txt-668R
Sequence:  CGGCTGAAAGGTTGCACAA
and the TaqMan?probe:
Name:    rDNA.txt-623T
Sequence: FAM-CGCCGAGCTGACCACTGCCCT-TAMRA

探针使用的是互补的探针,因为sense链上设计的探针中g含量太高.
引物通过Primer5检验分数并不高.
我想请教的是:
1.我的荧光定量PCR产物是69(仅仅是Taqman的,不是TaqmanMG
,虽然符合50~150bp范围,但是感觉还是比较短,不知道是否影响荧光定量.我师兄做的TaqManMGB探针大概都是120bp.
2.使用互补模板对于荧光效果有什么影响呢?

作者: 04906 时间: 2014-7-28 17:33

请教一下，我做的是肿瘤，应用倍比稀释作标准曲线，然后计算肿瘤和正常组织的比值，想和临床因素结合分析，不知改用什么检验方法？
谢谢！

作者: 831226 时间: 2014-7-28 17:34

老师您好：
关于荧光定量标准曲线的建立我想请教一下您如下问题：首先是不同浓度的融解峰不能重叠，融解温度相差大至2~3度，但是跑电泳看条带又是目的条带；同时感觉是浓度越稀融解曲线越容易出现一些小杂峰。那些杂峰也不是引物二聚体。
量外一个问题就是不同梯度稀释的模板跑出来的CT值分布不均匀，我做了两次两次结果都这样，总是前两个浓度均匀，后几个均匀但后几个浓度的CT值较前一二个浓度的CT值分布的紧奏些。开始我以为是我稀释模板那步没做好，第二次作时我就重新稀释了模板的，结果还是那样子。然后我就在思考是不是因为模板浓度低点然后CT值就会分布得均匀点呢？百思不得其解！很火急，万分感激老师不吝赐教！拜谢！！
如果老师能看到我的请求，我想把我的曲线图片传上来！

作者: lxh031 时间: 2014-7-28 17:35

定量和半定量有什么区别?

在real-time PCR中称为绝对定量和相对定量.绝对定量是检测待测基因有多少拷贝数.相对定量是检测实验组相对于对照组表达有无差异,表达改变的倍数

作者: is2011 时间: 2014-7-28 17:35

请问您,您知道哪个公司可以为客户做荧光定量PCR实验吗?我时间太紧张,今年要毕业,以前没做过分子方面的东东,想找个公司做一下。先谢谢了！！！

===============================================

上海有很多公司做啊.***,上海生工,闪晶生物.武汉也有:博尔生物

作者: is2011 时间: 2014-7-28 17:36

请问用Taqman探针和不用Taqman探针时，引物能一样吗。

======================

个人认为两者没有必然联系

作者: fox_79 时间: 2014-7-28 17:36

设计出的带有探针的引物可以单订引物,不订探针做染料法.

作者: 7437654 时间: 2014-7-28 17:39

大侠,你好,我是一个新手,现在在做RNAi实验,我要做荧光定量pcr,检测一下细胞干扰前和干扰后mRNA量的变化,但是我对荧光定量pcr不太了解,能否告知我整个实验的步骤大概是怎么样的?需要什么试剂?万分感谢!

作者: DONT 时间: 2014-7-28 17:39

请问，我用Taqman探针，采用看家基因相对定量，检测2个基因，2个基因的荧光标记不同，一个是FAM ，另一个是VIC。
请问
我做第一个基因的时候结果很好，敏感度很高，做第二个基因的时候结果不好，有的阳性对照cDNA浓度低的时候就检测不出来，这样导致我的第二个基因检测敏感度比第一个低很多，怎么办呢
拜托了，急啊

作者: summerxx 时间: 2014-7-28 17:40

就减小Ct值问题的一点心得，供大家参考

１，tRNA提取的质量不好有可能增大Ct值，很多说明书中都提到了这一点;

２，荧光燃料法real time PCR 大多购买现成的试剂盒，使用前一定仔细阅读参考书
，尤其是酶混合物是否需要提前加以变性。因为有些酶９５度变性后酶活性才能被释放。我以前一直没意识到这个问题，东西用了不少，时间费了不少，可Ct值非常靠后，产物量也非常少。

有什么错误之处还请大家指出。

作者: mimili_901 时间: 2014-7-28 17:40

threshold太高和太低说明什么？一直用UBC 做为管家基因，另外一个是要检测的基因。在肾脏检测良好，而在心脏就出现了异常。
在肾脏，内参和目的基因threshold在80-160范围浮动，PCR efficiency 90-130。
在心脏，内参75，目的基因》400。这是为什么？？？？？？有人遇到过这样的情况么？PCR efficiency 90-110。
RNA为不同的人用不同的方法提取，肾脏是用kit提取的，心脏用普通的trazol方法提取。但是均有多次提取RNA及其他实验之基础。
如果对于q－PCR的原始数据，需要手动调整阈值么，还是机器默认的阈值即可进行分析。手动调整阈值后的data比机器自动设置阈值的data，目的基因和内参的差异更小，也就是说统计学上更无明显差别。当然，我这次的实验结果，无论怎么分析都是没有统计学差异，或许是我分析的方法不对。
做标准曲线的时候，第一条，也就是浓度最高的那个总是不理想。去除后，曲线较好。是操作手法的问题么？
我把数据分开来分析，一共是7个文件，用winrar压缩上传的，敬请各位提供宝贵意见。

作者: join 时间: 2014-7-28 17:41

是我没表述清楚，还是大家都在休息呢？节后恳请各位给点建议。

作者: tangxin_80 时间: 2014-7-28 17:41

马上要接触real-time PCR，我是完全不懂，有什么建议可以先读一些什么书或paper吗？主要是用来入门的。谢谢。

作者: duoduo 时间: 2014-7-28 17:42

刚进实验室的小硕，请教：我想用荧光定量PCR扩增HER2基因，请问我选择什么做标准品来做标准曲线？请赐教,谢谢！

作者: bring 时间: 2014-7-28 17:47

用含有染料的普通pcr试剂盒扩增出的产物可以梯度稀释后做荧光定量pcr的标准曲线么？谢谢

作者: ritou1985 时间: 2014-7-28 17:47

请问：
PCR效率的合理波动范围为？
谢谢！

合理的波动范围3.322加减0.3

作者: zhenxin 时间: 2014-7-28 17:48

请教一下
本人自己制作乙肝变种的标准品,在实验过程中碰到的问题是:
1:用野生型血清处理的DNA作为模板可以得到很好的曲线.
2:但是,设计引物扩增得到的PCR产物作为模板却得不到很好的曲线.CT值很大.
3:将乙肝基因连接到T载体后提取的质粒作为模板的时候,曲线上反映出来的是什么都没有扩增.
其中,T-HBV菌株的测序结果是正确的,不知道是反应系数中做调整还是用质粒做模板需要经过预处理,请高手指点

作者: yjf1026 时间: 2014-7-28 17:55

我是用sybgren 1 做 real time ,因为sybgren是非特异结合双链,所以一般要在最后加上一个延伸温度（大于非特异物TM而小于产物的TM温度）?
以使非特异的小片段解链.

但我现在做的溶解曲线和电泳的结果都很好,没有见杂带,能否省去这步?

另外还想问一下:加了那个延伸温度一定能把非特异物在sybgreen 1 的溶解曲线上产生的峰去掉??如图上的黑圈
条件优化与加了那个延伸温度比哪个效果更好

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第一，既然没有非特异性产物，当然可以将这个温度省略了。
第二，你的融解曲线中那些小峰算不上非特异性产物，如果有非特异性产物，也无法通过你所谓的加一个"延伸温度"来解决。

作者: yjf1026 时间: 2014-7-28 17:55

你好，有个困扰我的问题想问下．
我用Ｔaqman探针，阴性（空体系）上机时也会出现很好的扩增曲线，大约８个里总会长１～２个，这应该不是试剂污染，可能是什么原因呢？
还有，
有时做灵敏度测定，空体系有扩增，而低浓度反而不长，实在很怪．

盼解答！

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我想阴性对照的出来大概原因是
1、PCR体系污染，无论PCR中哪一个体系的污染都有可能导致该现象。
2、还有可能的原因是引物设计特异性不强，所以有非特异性扩增。这时候你可以跑一下电泳，看产物的长度是否与预计的相同。

空体系有扩增，而低浓度的没有，那么你用什么水代替模板来补足空体系？可以看一下这个是否有污染。

作者: yjf1026 时间: 2014-7-28 17:55

求教：
1、RT-PCR用10ul做的话可以么？一般说最少要20ul体系，为什么？有什么区别？
2、为什么长片段不能（〉500bp）不能做SYBR GREEN？
万分感谢！

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仪器检测的时候需要一定的样品量，如果少于所需的样品量，会导致检测不够准确。
片段不能太长，主要是希望延伸的时候能够达到彻底的延伸。我们很容易明白如果片段太长，可能导致有一些链延伸无法彻底完成。

作者: yjf1026 时间: 2014-7-28 17:56

这是A公司的图：便宜呀，如果能有改善我还是会考虑的。

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不是太清楚，因素应该是比较多吧

作者: yjf1026 时间: 2014-7-28 17:56

请教一下
本人自己制作乙肝变种的标准品,在实验过程中碰到的问题是:
1:用野生型血清处理的DNA作为模板可以得到很好的曲线.
2:但是,设计引物扩增得到的PCR产物作为模板却得不到很好的曲线.CT值很大.
3:将乙肝基因连接到T载体后提取的质粒作为模板的时候,曲线上反映出来的是什么都没有扩增.
其中,T-HBV菌株的测序结果是正确的,不知道是反应系数中做调整还是用质粒做模板需要经过预处理,请高手指点

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纯化的质粒做模板是不需要什么预处理的。不知道你引物设计是否正确？用PCR产物或质粒作为模板的时候，都只有一段序列是病毒DNA的序列，必须在这个序列内设计引物作为定量PCR的引物。

作者: yjf1026 时间: 2014-7-28 17:56

请问：
PCR效率的合理波动范围为？
谢谢！

合理的波动范围3.322加减0.3

====================================================================

这个标准的具体数值，我没有看到过，但是最大的只能到3.322，再大，那就超过理论值了。

作者: yjf1026 时间: 2014-7-28 17:57

请问如何设计试验确定反应体系的循环数呢?

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一般可以设置35个循环，如果还有些没有扩增出来40个循环试试。

作者: yjf1026 时间: 2014-7-28 17:57

我做实时荧光定量。用染料有非特异性条带，就重新设计探针引物。现在到30几个循环后才出来。别人说是模版浓度不够。不过染料都行，探针怎么不行呢？不明白。PCR混合缓冲液做染料时是买的，探针时是自己配的是不是酶不好使啊。

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那么可能体系需要优化。或者PCR体系中的哪一个元素不好。

作者: yjf1026 时间: 2014-7-28 18:08

想请教做实时PCR内参的问题，我想用18s做内参，不过国内都很少做，这是为什么啊，我看到国外关于内参评价，18s是最好的啊。还有我在外文文献上查到引物和配套探针，可以直接用还是需要自己设计啊。非常感谢

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内参基因的标准是表达量比较高，并且在不同的处理情况下表达都比较恒定。18s可以做

作者: jujuba 时间: 2014-7-28 18:10

我想用2 -△△CT法进行相对定量，用天为时代的燃料试剂盒，做多大体系比较合适，还有一定要做看内参和特异基因的扩增效率是否一致的实验么？特异基因的扩增产物为300bp，不知道行不行。

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-28 18:17

你的融解曲线没有问题，那些小峰是正常的。
大于非特异物TM而小于产物的TM温度，这一步是加在延伸后，读板之前的一步。作用就是你说的将非特异性产物解链。只要你没有非特异性的产物，可以省去你说的那一步。

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我的反应条件是按照TAKARA试剂的说明书来的：第一步95℃10s，第二步95℃5s继而60℃31s 共40个循环
试做了三个标本，其中就有两个标本的所有检测基因的融解曲线均有杂峰（且都是在70－75℃间）我检测基因（包括内参）的引物是参用外国文献并进行了blast证实是没问题的。那个杂峰的存在我不知道是引物二聚体还是非特异扩增，请帮忙鉴别，如何改进？如果是非特异扩增是否应该如上所说增加一个介于非特异扩增产物和目的基因产物的Tm值之间的延伸温度？
下面是我发的求助帖子，里面有具体的描述和图片。cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&amp');id=8408020&sty=1

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-28 18:18

想请教做实时PCR内参的问题，我想用18s做内参，不过国内都很少做，这是为什么啊，我看到国外关于内参评价，18s是最好的啊。还有我在外文文献上查到引物和配套探针，可以直接用还是需要自己设计啊。非常感谢

内参基因的标准是表达量比较高，并且在不同的处理情况下表达都比较恒定。18s可以做

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此外，我用的内参就是18s的，帮我作定量的检验科的老师说我的内参表达太高了（具体图片见上楼中链接）不好

作者: u234 时间: 2014-7-29 10:37

有个问题想请教一下：
我实时定量PCR循环数是35，看扩增曲线好像已经到了平台期，那此时PCR扩增后的产物跑胶，不同组电泳图条带的亮度肉眼是否还会有差别（实时定量检测出来原始模板拷贝数相差教大的情况）
谢谢！

作者: plaa 时间: 2014-7-29 10:37

问题已经解决,是我把检测区域弄混了.
另外,还有一个问题.荧光pcr没有曲线,而把pcr管中的产物去做凝胶电泳,可以检测到目的条带,我认为问题是出在探针上,不知道做乙型肝炎的探针设计应该注意哪些问题,请指点.

作者: fsdd817 时间: 2014-7-29 10:38

楼主你好：
本人是完全的新手，正准备用荧光定量PCR（打算用sybr green染料）测脑中两种酶的表达，导师让我先设计引物，请教楼主：
（1）普通PCR的引物是否可以直接拿来作荧光定量PCR的引物？
（2）以下是我在一篇文献中查到的引物，请帮忙看一下是否可用：
酶1 Sense: catggggaagggaggtaaccag ； Antisense: tcatttatggaggtaagcatc
酶2 Sense: atggctcccgacccggtgccg ； Antisense: ctattggtgaaggtaagcgtc
（3）酶1的上下游引物间约有1200bp，酶2的上下游引物间约有1300bp,这样的距离是不是有可能影响结果啊？
不知到我表达清楚了没，请楼主不吝赐教，拜谢！

作者: mamamiya 时间: 2014-7-29 10:40

请教一个问题,做标准曲线的模板可否用目的基因的PCR扩增产物,谢谢.

作者: duoduo 时间: 2014-7-29 10:46

楼主，能不能具体讲述一下相对定量的方法？比如怎样用△△Ct方法计算？最近在做数据，很是着急。先谢谢啦！

作者: huifeng0516 时间: 2014-7-29 10:47

我做实时荧光定量，事先已用普通PCR扩增过，摸索出了稳定pcr的条件，
但是用sybergreen做的时候，按照摸好的条件，要到40几个循环后才出来，
而且荧光值很低，是模版浓度不够吗？
熔链曲线观察是有峰的，而且没有二聚体，证明还是扩出来的，
但是普通pcr的时候25ml体系加1ul跑出来的条带很亮啊，
按理说sybergreen的效率应该很高，不会这样才是啊，
请问可能是什么原因呢？

作者: avi317 时间: 2014-7-29 10:48

定量PCR技术

定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术有广义概念和狭义概念。广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。
??广义概念下的定量PCR技术可以分为五种类型：
（1）外参法+终产物分析。所谓“外参法”是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。这种类型没有对样本进行质控监测，易出现假阴假阳结果，没有监测扩增效率，定量不准。
（2）内参法+终产物分析。所谓“内参法”是指样本与阳性参照在一个反应容器内反应。这种类型对样本进行质控监测，排除假阴结果，但是定量不准。
（3）外标法+过程监测。这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，但是无法排除假阴结果。
（4）内参法+过程监测。由于样本与阳性参照在一个容器内反应，用同样的Taq酶和反应参与物，存在竟争性抑制，起始模板量浓度高的反应会抑制起始模板量浓度低的反应，所以定量不准。
（5）外标法+过程监测+内对照。这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，同时排除假阴结果。这种类型是应该提倡的。PCR过程的监测有多种检测模式。最常用的有三种检测模式：
（1）R Green I 检测模式。温度循环为94—55—72°C三步法，只有引物，无探针，荧光染料镶嵌在双股螺旋链中间。通过对特定方向的强荧光检测获得信号，这种试剂检测模式易产生非特异信号，且本底光较大。
（2）解探针模式（Taqman）Hydrolysis Probe 。温度循环为94—60°C二步法，不仅有引物，还有另外一个特异针对扩增模板的探针在引物对之间。在探针相邻两个碱基上分别结合两个荧光染料，一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态。当Taq酶在60°C延伸扩增链时，遇到探针，利用Taq酶5`—3`外切酶活性将探针水解成单个碱基，单个碱基之间距离较远，第一个染料的能量无法传给第二个染料，只好通过发射特征光子回到稳定态，通过对溶液中第一个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式增加了检测信号的特异性，但是由于利用了Taq酶5`—3`外切酶活性，一般试剂厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标，没有同时给Taq酶5`—3`外切酶活性定标，不同批号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔点温度（Tm）仅要求其高于60°C，这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐，而且无法做质控检测。
（3）杂交探针（Hybridization Probes）模式。温度循环为94—55—72°C三步法，有引物，二个特异针对扩增模板相邻的探针在引物对之间，在一个探针3`碱基上结合一个荧光染料，在另一个探针5`碱基上结合第二个荧光染料。在55°C时，两个探针都刚好接合在模板上，第一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态，通过对结合在扩增模板上双探针中第二个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式中荧光信号与特定杂交温度相关，探针的浓度始终保持不变，因此可以在扩增后检测熔解曲线作为信号的特异性质控。另外这种试剂检测模式可以用于点突变检测。
??狭义概念的定量PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果(扩增效率为零)。在国家没有出台阴阳判定标准时，所用PCR系统灵敏度最好达到一个拷贝（一个病毒）。从理论上说，只要有一个拷贝数，样本就算阳性；一个拷贝数都没有才算阴性。

作者: windy+++ 时间: 2014-7-29 10:48

多谢楼主,我用SYBR法定量,引物无引物二聚体,无污染,为何我的对照的荧光强度也随着扩增而增加,溶解曲线显示不是我要扩增的目的片段.很疑惑,不知什么原因?望告知.

作者: plaa 时间: 2014-7-29 10:49

大侠，能否请问探针法用哪个试剂盒比较好？价格如何？

作者: 04906 时间: 2014-7-29 10:50

求助:

我做基因组DNA的定量分析,为什么一个点3次重复的结果重复性不好?

作者: 00无名指00 时间: 2014-7-29 10:50

大侠你好!
我是新手刚准备做定量PCR,能否详细跟我说一下需要准备些什么呢?非常感谢!

作者: moonlight45 时间: 2014-7-29 10:52

请教大侠:
目的基因的ct值和看家基因的ct值相差10圈,对结果影响大吗? 一般调整到相差不要大于多少为好?
我觉得只要目的和内标一批上样就可以了!

作者: IAM007 时间: 2014-7-29 10:52

请问大侠：
目的基因和内标基因的ct相差过大影响大不？内标16圈，目的26圈，有必要将摸板稀释至和内标差不多的圈数？
您觉得它们相差不能超过多少圈为好？
我觉得问题不大！

作者: 羊咩咩 时间: 2014-7-29 10:56

请教：

定量PCR扩增，基线部分荧光就上升很厉害，是什么原因？
扩增信号弱，但电泳显示条带单一并很亮，为什么？

请高手指教！！

作者: remenb 时间: 2014-7-29 10:57

请问BSA对PCR的具体起到什么作用？是否如一些文章介绍说对体系中的TAQE起保护，以及对PCR有增强效果？
如果对PCR有增强的话，能否详细介绍一下其原理?

顺便问一下，BSA对质粒有保护作用吗？

作者: is2011 时间: 2014-7-29 10:57

请教您：
我用SYBR GREEN 做基因拷贝数相对定量。三个复孔，但同一样品复孔间CT值时好时坏。标准曲线是两倍剃度拉的。曾经拉的很好但不稳定！很苦恼想了很多办法解决不了。恳请赐教！！不甚感激！！

作者: sunnyB 时间: 2014-7-29 10:58

“虽然不知道确切的RNA的浓度，但是做出标准曲线之后可以计算出扩增效率”？请教tgb0yhn，提取的总RNA也可直接做标准品吗？

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-29 10:58

楼主你好：
本人是完全的新手，正准备用荧光定量PCR（打算用sybr green染料）测脑中两种酶的表达，导师让我先设计引物，请教楼主：
（1）普通PCR的引物是否可以直接拿来作荧光定量PCR的引物？
（2）以下是我在一篇文献中查到的引物，请帮忙看一下是否可用：
酶1 Sense: catggggaagggaggtaaccag ； Antisense: tcatttatggaggtaagcatc
酶2 Sense: atggctcccgacccggtgccg ； Antisense: ctattggtgaaggtaagcgtc
（3）酶1的上下游引物间约有1200bp，酶2的上下游引物间约有1300bp,这样的距离是不是有可能影响结果啊？
不知到我表达清楚了没，请楼主不吝赐教，拜谢！

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普通PCR的引物要看扩增片段大小，如>400BP以上，就不能用于作荧光定量PCR的引物。
酶1上下游引物Tm值相差12℃，而酶2上下游引物Tm值相差21℃，且引物自身有连续4个碱基以上的互补，所以这两对引物不太可用于荧光定量PCR。

作者: gogo 时间: 2014-7-29 11:05

楼主好
我刚刚接触荧光定量PCR，我用的是taqman探针法，绝对定量检测病毒含量，我用质粒建立的标准品，我稀释标准品从107～102可每次出来的结果前四个点是一条线且CT值的梯度在3左右。可是后两个点在另一条线。重新稀释又是如此。

作者: yonger 时间: 2014-7-29 11:05

你好：我准备做血液和肺匀浆的Bcl-2,Bax的定量PCR。我是个初初学者，请问我应该怎样准备实验1.2.3.......？越详细越好！先谢了！

作者: 04906 时间: 2014-7-29 11:06

不好意思，我是个新手。请问下real-time PCR 与RT-PCR之间在做法上有哪些不同？我想检测疾病不同时期某蛋白表达的变化是不是前者好些？谢谢！！

作者: ritou1985 时间: 2014-7-29 11:07

现在又发现有实时荧光定量Rt-PCR的叫法，这种说法对吗？我想他的意思其实就是用荧光定量的方法做Rt-PCR，但能不能这么叫呢？

作者: ritou1985 时间: 2014-7-29 11:07

普通PCR的引物要看扩增片段大小，如>400BP以上，就不能用于作荧光定量PCR的引物。
酶1上下游引物Tm值相差12℃，而酶2上下游引物Tm值相差21℃，且引物自身有连续4个碱基以上的互补，所以这两对引物不太可用于荧光定量PCR。

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我想请问扩增片段一定要小于400bp吗？我听有些同行说与扩增片段没太大关系的，，到底怎么回事？？

作者: xyw5 时间: 2014-7-29 11:07

我想问问PCR过程中荧光值的大小受什么影响?我做的时候,发现我的曲线最高也超不过500,而同一台PCR仪,别人做曲线经常可以高到4000~5000(X轴数值),这是怎么回事啊.

作者: wmp1234 时间: 2014-7-29 11:08

我们实验室刚开始用real time做半定量PCR,仍旧是对结果的统计方法搞不清楚。我们需要比较两个品种的猪仔同样处理前后，某个基因mRNA的变化（品种间和一个处理前后都要比较），因为无法确定哪个是对照组，因此ddCt法似乎不合适，请问还有没有别的方法？

作者: remenb 时间: 2014-7-29 11:17

最近我在一些生物公司的宣传单上看到了"实时荧光定量Rt-PCR",,请问楼主这种说法对吗??

作者: INK 时间: 2014-7-29 11:18

请教一个问题，我做荧光定量时，预实了一次，做出来有标准曲线，昨天就开始做实验，结果标准曲线就没了，不成梯度，除了加样原因，还有可能是什么原因呢，谢谢

作者: damingxia0904 时间: 2014-7-29 11:18

大虾你好：
小弟首次作定量PCR，由于我们所用内参的长度在300bp左右，而我们设计的引物所扩增出来的条带在130bp左右，我想既然是一种确定不同虫期差异表达的相对定量问题，是否可以用该内参做标准曲线？
请大家不吝赐教，不胜感激！
新手，见笑！

作者: 8princess8 时间: 2014-7-29 11:19

请教：

我的定量PCR准备使用单标记荧光探针与双链嵌入燃料相结合的方法，供体为Syber-green 1,受体为Cy5,请问在哪个公司可以合成探针？

作者: u234 时间: 2014-7-29 11:19

请问知道做real time时，cDNA的浓度最好在什么范围内？

作者: u234 时间: 2014-7-29 11:20

i had finished my real-time pcr, but confused about analyse.

firstly i analyze the result with the Ct value:
                                                            Ct (treatment)/Ct(GAPDH)
                                                            _____________________

                                                            Ct (control)/Ct(GAPDH)
                  but this ratio showed little difference beteen two groups!

and then i analyze the result with the linear value:

                              1*2Ct(GAPDH) =X*2Ct (treatment)
                                 ____________________________
                                 1*2Ct(GAPDH) =X*2Ct (control)

                  this time i got a significant results, but i really have no idea about the analyse of real-time pcr.  could you tell me in generally how to analyze it, thank you very much!

PS:i used the sybgreen to do this real time pcr , and i just want to know if there is different between the treatment and control group in RNA expression.

作者: qhyu 时间: 2014-7-29 11:22

请教:如何下载SDS软件？

作者: xue258 时间: 2014-7-29 11:22

版主：
你好！
看来你真是很专业啊，能解决这么多问题。我是最近才刚接触荧光定量PCR 的，急需设计引物，手动设计很麻烦，但从网上下的Primer Express都用不了，不知您有没有这个软件啊，万分感谢！

作者: caihong 时间: 2014-7-29 11:23

前两天我做了实时荧光定量PCR(相对定量)，现有3个问题问一下：
      1.相对定量不知道推荐走几个Stage，绝对定量一般是走3个大Stage，我们所老师和我说相对定量走4个Stage，就是加上 95度15秒－－>60度1分钟－－>95度15秒。不知道你们相对定量推荐几个？

      2.我发现好像只有绝对定量才能做熔解曲线，相对定量好像不能做熔解曲线？该如何解决呢？可以跑完相对定量再单独跑一个熔解曲线么？熔解曲线的灵敏度比跑电泳更高么，一般不需要再跑电泳排除有无其它DNA混杂了么？

      3.我这两次作出来的直方图误差条最大值与最小值之间的线都有点长，是不是因为上样重复少造成的。我一般每个样重复3次，我看Protocol上面都是重复4次。不知该如何更好解决误差条偏大？

谢谢高手指点。。。。。不胜感激。。。。。

作者: caihong 时间: 2014-7-29 11:23

最近做荧光定量PCR遇到麻烦,试剂是Bio-rad SYB green,仪器是 MJ opticon 2 ,模板是cDNA
做的荧光读数和溶解曲线如图,
可以看出,荧光读数很低,溶解曲线问题不大.于是把PCR产物98度10 min变性后立即冰上复性,取8ul电泳,
左起第三泳道是,产物大小对的,我认为条带也很亮,为什么读数低,排除仪器和试剂的问题,请高手帮忙分析一下,谢谢!

作者: wmp1234 时间: 2014-7-29 11:23

阴性有扩增,除了污染，还会有别的可能吗？利用溶解曲线如何判断是目的产物还是引物二聚体（仅1个峰）他们对应的温度可以计算出吗？（产物跑电泳除外）。谢谢

作者: caihong 时间: 2014-7-29 11:24

我刚准备想用实时PCR做实验,我已经知道我目的蛋白的核苷酸序列,请问接下来怎么设计引物和双标记探针呀?我是用mRNA反转录来做的.谢谢!

作者: zwsyrt 时间: 2014-7-29 11:24

在作定量pcr时遇到问题想请教：用的是sybr green染料，用的质粒模板108-103几个梯度，结果ct值都大于30，而且线性关系也不好，浓度高的ct值还大些。我想可能是模板有抑制作用，用水稀释还是这样。后来用普通pcr和加了染料的同时作pcr，电泳发现加了染料的明显弱一些，难道染料的抑制作用这么明显，该怎么继续优化条件呢？请指导。

作者: fei1226com 时间: 2014-7-29 11:25

最近做荧光定量PCR遇到麻烦,试剂是Bio-rad SYB green,仪器是 MJ opticon 2 ,模板是cDNA
做的荧光读数和溶解曲线如图,
可以看出,荧光读数很低,溶解曲线问题不大.于是把PCR产物98度10 min变性后立即冰上复性,取8ul电泳,
左起第三泳道是,产物大小对的,我认为条带也很亮,为什么读数低,排除仪器和试剂的问题,请高手帮忙分析一下,谢谢!

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读荧光的是不是在72度结束后读的？

作者: 白白的 时间: 2014-7-29 11:25

请问楼主：
在实验中有个别样品中的几个基因没有重复性是怎么回事，重复间的体系都是一模一样的，而且在有些样品中这些基因的重复性又很好。望赐教，谢谢！

作者: lixi559 时间: 2014-7-29 11:26

请问楼主：
在实验中有个别样品中的几个基因没有重复性是怎么回事，重复间的体系都是一模一样的，而且在有些样品中这些基因的重复性又很好。望赐教，谢谢！

作者: youyou99 时间: 2014-7-29 11:27

您好，我做的real time pcr,融解曲线很杂乱，标准曲线也不共线，做了好多次都没做出来一个可用的结果。不过以前老板在国外用的同样的引物，做的很好，我一直找不到原因谢谢

作者: zwsyrt 时间: 2014-7-29 11:41

您好，我做的标准曲线还可以，但检测样本原始浓度qpcrde Ct值较高在42左右，不在标准曲线的Ct值内。我的检测样本是从单个卵母细胞内提取转录生成的cdna,不知有没有不增加提取细胞的数量而是实验的Ct值增加的方法。谢谢

作者: ladyhuahua 时间: 2014-7-29 11:42

takara的试剂盒，大概在1500元，400个反应。
请问具体是什么试剂盒啊，我看了Takara的网站好像没有这么便宜的啊？
● Real Time PCR 相关制品下载说明书
  Perfect Real Time系列产品
SYBR甈remix Ex TaqTM (Perfect Real Time)

Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time)
ExScriptTM RT reagent Kit (Perfect Real Time)
SYBR瓻xScriptTM RT-PCR Kit (Perfect Real Time)
ExScriptTM RT-PCR Kit (Perfect Real Time)
EASY Dilution (for Real Time PCR )
One Step SYBR

作者: qumm1985 时间: 2014-7-29 11:43

请问绝对定量需要管家基因吗,是用一条标准曲线还是各做一条呢,数据应该如何处理呢,请指导,谢谢!

作者: vvmmoy 时间: 2014-7-29 11:43

请问：低浓度的SYBR GreenI 应该如何保存在4度条件下，我对
10000×的原液稀释到1×，保存在4度，但荧光强度很快就降低，冻溶也不行，有好的建议吗？谢谢！

作者: guagua 时间: 2014-7-29 11:44

请问楼主有没有用tanman 探针做的实时定量的资料可以共享下啊。刚开始用探针作，心里没底，如果有资料可以看看的话，可以上手快一点。先谢谢了阿！

作者: ququer787 时间: 2014-7-29 11:44

请教大侠,我实验中同一个样品的四个重复,但是结果的Ct 值差别比较大,我将基线上调一点后,Ct值就几乎一样了,怎么回事?基线可以随便调吗?

作者: #问号# 时间: 2014-7-29 11:46

请问标准曲线怎么做？？

作者: one 时间: 2014-7-29 11:47

我刚开始做PCR,用的是SYBR Green 1的,我想问一下:
            1.我的扩增片段是313,是不是太大了啊,发文章的时候会不会被杂志认可啊.
            2.目的基因的CT最好在什么范围内啊,怎么调整啊.
      谢谢了!!!!!

作者: 079777chao 时间: 2014-7-29 11:48

楼主，请教一下
我在用HEX探针做REALTIME的时候，刚开始的时候（0-5个反应）荧光值特别高能到500多，随着反应的进行逐渐降低，但并没有出现明显的扩增曲线，不知道是什么原因，会不会是由于探针设计的原因造成的呢？
谢谢！！！

作者: linlinstar 时间: 2014-7-29 11:48

请教一下
我想做REAL TIME PCR，为了先验证一下提取的RNA以及引物没有问题
就先做了普通的PCR
引物是参考国外权威的文献的
我要测两个东西，一个普通PCR后跑电泳可以跑出条带
另外一个，怎么跑都没有条带
我想问下楼主：
普通PCR的引物和REAL TIME的引物是不是通用的？我的引物是查来的，文献上写的是REAL TIME的，我用来先做普通PCR的，一个跑出来了，另外一个跑不出来，如果不通用的话，是否意味着虽然我普通PCR跑不出来，但是我做REAL TIME 或许可以得到结果？
谢谢

作者: PINK 时间: 2014-7-29 11:49

请问100bp以下的条带如何区分引物二聚体还是自己所要的目的片段？？如图所示右侧的三个条带，是不是目的片段？请各位战友指正

作者: lixi559 时间: 2014-7-29 11:49

请问，为什么我的扩增曲线平台期是折线啊，一点都不平滑。

作者: popo520 时间: 2014-7-29 11:50

我的引物也是从文献上查找的，做real-time PCR融解曲线和扩增曲线还不错，但是普通PCR也是很多杂带甚至扩不出来。我个人觉得是因为普通PCR和real-time PCR反应体系不一样。

作者: quiqui008 时间: 2014-7-29 12:47

我的课题是于荧光定量PCR的，用的是takara的SYBR Green试剂盒，现在准备要做标准曲线，用普通PCR，电泳，纯化的DNA,我想请教一下我想把纯化的DNA定量，用紫外分光光度计测准吗，还有我测的是OD值，怎么转换为拷贝数啊，我在文献上，很多都通过转入载体后进行定量，我要是直接用纯化后的DNA定量的话，怎么转换啊，我查文献上说按每1OD值双链DNA片段（1kb）相当于4.74×1013分子/ml，这个换算可靠吗，在哪有明确的相关说明呢，我的片段是285不知道适不适合这个公式，这点我非常苦恼，哪位知道麻烦尽快告诉我啊！谢谢！

作者: gemei0115 时间: 2014-7-29 12:47

我想请问相对定量和绝对定量的区别是什么啊？我想做某一个基因在不同组织的表达差异表达是做相对定量还是绝对定量啊？

作者: kuaizige 时间: 2014-7-29 12:49

请指点：

IL-8 rat
f: TTG GAG ACC CCT GCC TGG  tm:59.9
r: ACT TCT CCA CAA CCC TCT GC tm:57.1
real time pcr:
Protocol
Cycle  1:(  1X)
Step  1: 95.0for 05:00
Cycle  2:( 40X)
Step  1: 95.0for 00:15
Step  2: 63.0or 00:45
Data collection and real-time analysis enabled.
Cycle  3:(  1X)
Step  1: 95.0for 01:00
Cycle  4:(  1X)
Step  1: 65.0篊牋for 01:00
Cycle  5:( 80X)
Step  1: 55.0for 00:10
Increase setpoint temperature after cycle 2 by 0.5
Melt curve data collection and analysis enabled.

作者: one 时间: 2014-7-29 12:50

我的课题是于荧光定量PCR的，用的是takara的SYBR Green试剂盒，现在准备要做标准曲线，用普通PCR，电泳，纯化的DNA,我想请教一下我想把纯化的DNA定量，用紫外分光光度计测准吗，还有我测的是OD值，怎么转换为拷贝数啊，我在文献上，很多都通过转入载体后进行定量，我要是直接用纯化后的DNA定量的话，怎么转换啊，我查文献上说按每1OD值双链DNA片段（1kb）相当于4.74×1013分子/ml，这个换算可靠吗，在哪有明确的相关说明呢，我的片段是285不知道适不适合这个公式，这点我非常苦恼，哪位知道麻烦尽快告诉我啊！谢谢！

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OD值与DNA质量的转换和溶解DNA的溶剂有关，在水里和在TE里头转换系数是不一样的。具体可以查阅相关文献。
从OD转换成质量之后，再根据DNA分子的分子量，就可以计算出拷贝数了。

为什么文献里头很多都通过转入载体后进行定量，我觉得有几个方面：
1、转入载体的过程，经过酶切连接等步骤，会将其他一些和目的片段不同的DNA分子过滤掉（不会被接到载体上），这样用测量载体的拷贝数排除了一些非目的片段所得到的结果更加准确。
2、载体的长度都比目的片段的长度长，分子量大，这样用质量除以分子量计算得到的拷贝数，从纯数学的角度上说，误差更小。

当然，我觉得你说的直接纯化DNA片段然后测OD再计算拷贝数，理论上是完全行得通，就是不知道这个误差有多大，是否是你能够承受的范围。

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-29 12:50

请问绝对定量需要管家基因吗,是用一条标准曲线还是各做一条呢,数据应该如何处理呢,请指导,谢谢!、

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一般是需要参比基因，两条标曲！数据处理看一下说明书就好了！

作者: xueyouzhang 时间: 2014-7-29 12:51

楼主好!
请问用荧光染料做的定量PCR结果准确度是否比较低?
选择荧光探针有什么特别的标准吗?(比如宝生物的TaqMan探针就分为淬灭基团为TAMRA,ECLIPSE和BHQ等)
如果方便的话,可以帮我这个菜鸟提供些经验,那个公司的定量PCR试剂盒和探针比较物美价廉啊
谢谢!

作者: xueyouzhang 时间: 2014-7-29 12:53

再问个比较白痴的问题啊.
请问如果我用探针法的话,目的基因和管家基因在同一管里跑会不会对扩增结果产生影响啊?
或者说分两管但同一批跑的结果会更好?
谢谢

作者: lxh031 时间: 2014-7-29 12:53

我的熔解曲线老是有一个拐点，怎么能消除？万分期待您的解答！！

作者: lxh031 时间: 2014-7-29 12:54

有没有可能污染？
我看你标准曲线的基本上是最低浓度的那个点偏离标准曲线，如果你把最低浓度的那个点删除掉，应该还是比较正常的。
有一种可能就是体系污染了，比如都污染了10e+3个拷贝，那么如果你加入模板量是10e＋3，这是候CT值就会比正常的少1，如果你加入模板量为10e＋4,那么这是候ct值只比正常值少一点点，如果你加入10e＋5，那么这时候对ct值已经没有影响了。也就是说模板浓度越低的时候，受污染之后产生的误差越大！。所以我感觉你的实验可能受到了污染，导致你的标准曲线中低浓度那一点偏离了标准曲线，这样你的整个R2值就变低了。

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我的标准曲线也出现了类似的问题，您说的污染是指操作过程污染？有没有可能是RNA质量的问题，我的RNA能分出三条带但第二条最亮。也就是说出现这种情况有没有可能是因为RNA降解了？？？谢谢！

作者: nut6694 时间: 2014-7-29 12:54

你好，还有一个问题，我做的持家基因的标准曲线再去了最低浓度的三个点及另外的一个点之后R值可达到-3.23，标准曲线显示10倍稀释的CT值为21，但按这一稀释浓度扩增出全部样品的CT值却在16-17之间，不明白是为什么，期待您的解答~~~

作者: jkobn 时间: 2014-7-29 12:54

问一个问题，从组织中提取的RNA在用spectrophotometer 测量了浓度后，均在40到130ng每微升，那种40 50 ng 的，在做RT real-time PCR还需要稀释吗

作者: kuohao17 时间: 2014-7-29 12:55

大侠你好！
1；我用RT-PCR产物做标准品，做了10的-1到-5方稀释倍数，结果这5个CT值都在22到24内，搞的标准曲线不很差，请问这是什么情况？
2；我的real-time PCR程序为，95°,10s;95°,5s,60°s,15s,72°,31s,40循环,溶解曲线就成了抛物线了，没有72°这一步的时候还有正常的溶解曲线的，ABI7000的机器。
3；另一个基因相关系数总是达不到两了9以上，用RTPCR产物做的标准品，难得只能转质粒才能做好吗？

作者: bamboo16 时间: 2014-7-29 12:55

实验中的real-time PCR数据通过机器直接得到：CT平均值（mean CT）、CT值的标准差（CT-SD），我通过2 -△△Ct 公式计算出ddCT值（相对表达水平），但是不知道如何求ddCT值的SD和P值？

举个例子或许更容易说清楚：

House-keeping gene: GAPDH

Target gene: CCL6

Ctrl group:
GAPDH
3次CT值 18.21；17.89； 18.15
平均值：18.08
SD值：0.17222

CCL6
3次CT值 31.79； 32.08； 31.68
平均值 31.85
SD值：0.20903

Experiment group:
GAPDH
3次CT值 19.88; 19.63; 19.78
平均值 19.76
SD值0.12777

CCL6
3次CT值 33.35; 33.07; 33.63
平均值 33.35
SD值：0.27807

这样通过公式求出的CCL6的ddCT=1.132883885

但是如何求这个ddCT值的SD，及其P值大小？

谢谢大家了！

作者: taoshengyijiu 时间: 2014-7-29 12:56

请问最后结果怎么分析？dealt ct值差异多大才算有意义？

作者: 子衿青青 时间: 2014-7-29 12:57

可以的，只是容易降解。

作者: wmp1234 时间: 2014-7-29 12:58

问题一：是你没稀释好，稀释好的话应该差3.3个左右的循环每个样品之间。

作者: wmp1234 时间: 2014-7-29 12:58

我想问问看，我们提出来的RNA比较少，如果经过除酶处理就有可能损失殆尽，，但是不除酶又避免不了DNA痕量污染的问题，真是麻烦。刚刚做上去的Real-time就连RNA阴形对照也有扩增曲线，而且Ct值还比较小，但是其他的孔道做出来的东西和以前没有污染的时候，是一样的，且扩增情况很好，副孔重复性都不错。我想问问看，这样的DNA痕量污染到底对这种实验的结果有无影响？如果有，又体现在什么方面？请高手给予执教，谢谢了~
对了我做了三个对照，阳性对照，隐形对照，空白对照，阴性对照加的是：RNA模版。

作者: wmp1234 时间: 2014-7-29 12:59

对了，如果是存在DNA痕量污染的话，这种影响体现在什么方面呢？会不会原来出不来产物的孔出现了产物？还是可能该出现产物的孔被DNA竞争掉了，所以出不来？很多疑惑啊。不是我不想除DNA，也不是我不想设计引物，太多原因了。***帮忙。

作者: 阿k 时间: 2014-7-29 13:00

你好。刚开始做SYBR real time。准备做扩增效率比较。（逆转录和PCR都是用的TOYOBO的试剂盒）。有几个问题不是很明白，望指教。

1.提取总RNA后测浓度，1ug RNA RT成 20ul cDNA.然后是将cDNA直接倍比稀释后看扩增效率，还是需要把cDNA稀释后（如稀释n倍）再做倍比稀释看扩增效率。
2.每个样都要做复孔吗

作者: plaa 时间: 2014-7-29 13:00

你好。刚开始做SYBR real time。准备做扩增效率比较。（逆转录和PCR都是用的TOYOBO的试剂盒）。有几个问题不是很明白，望指教。

1.提取总RNA后测浓度，1ug RNA RT成 20ul cDNA.然后是将cDNA直接倍比稀释后看扩增效率，还是需要把cDNA稀释后（如稀释n倍）再做倍比稀释看扩增效率。
2.每个样都要做复孔吗

作者: ii077345 时间: 2014-7-29 13:03

请教：
荧光定量PCR的基线，是怎么确定的呢？初学者，望有较详细解析。谢谢大侠！

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基线(Baseline)是指PCR开始时信号很低、接近背景且比较平稳的那个阶段。起点要避开开始几个循环由于高温导致的信号增高，设在信号已经降到背景高度且能维持平稳的地方，一般在3到6个循环之间；终点要避免覆盖信号已经开始有明显增长的地方，一般在本组数据中最小的CT值前再3个循环处。另外，起点与终点之间最好能间隔8个循环以上，以满足统计基线标准偏差的数学要求。

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-29 13:04

不好意思，我是个新手。请问下real-time PCR 与RT-PCR之间在做法上有哪些不同？我想检测疾病不同时期某蛋白表达的变化是不是前者好些？谢谢！！

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荧光定量PCR：特异性强、灵敏度高、可直接对产物进行定量、解决PCR污染问题。看表达变化可以用相对定量做。

作者: ukonptp 时间: 2014-7-29 13:05

大侠你好，我是个新手，想问一下检测一种病毒用real time PCR,是用绝对定量，还是相对定量？这是怎么判断的，我看了一些说明，但还是不太明白，那位大侠能通俗的解释一下吗？感激不尽！

作者: bring 时间: 2014-7-29 13:05

请高手指点：最近在做绝对定量，先是摸索用质粒做标准曲线，原液的CT值为10.20，想把CT值控制在15--30之间，后把原液稀释百倍后当做标准曲线的第一个点，依次10倍稀释下去，共5个点，但是出现了CT值没有拉开距离的情况，曲线相互重叠，看起来像是没有稀释一样，理论上10倍稀释，CT值应该相差3.3左右；原本以为可能是没有稀释开的原因，但是连续重复5次依然是这样的结果，百思不得其解，请高位大侠给与指点，感激不尽。

作者: ending 时间: 2014-7-29 13:06

请问在伯乐的仪器上在那里可以看到扩增效率呢？谢谢

作者: rxcc33 时间: 2014-7-29 13:08

你的意思是不是担心标本间相互污染了，我觉得这种可能性不大，当然如果你操作有问题那是另一回事，这种贴膜既然能生产出来而且用的时间是不短了说明产品肯定不能出现你说的问题，而且现在的仪器都带有热盖装置所以出现你说的情况不大，我觉得你可能存在问题有可能是加样时存在污染的情况，或是你使用的试剂导致了CT值发生了改变，个人想法而已

作者: 3648755 时间: 2014-7-29 13:08

各位大侠，我是用基康的taqman-mgb做基因的snp，不需要产量，只想用这种方法来定性。
需要管家基因做内参照吗？
需要标准曲线吗？
试着用普通的pcr的管子做了几个，ct值都偏大有35.3 36.4
请问大家什么原因？模板是10ng每微升的
十分感谢

作者: DONT 时间: 2014-7-29 13:10

请问，溶解曲线主峰后面有许多杂峰是怎么回事，主峰前面很好。十分感谢！

作者: jkobn 时间: 2014-7-29 13:11

我也想问几个低级的问题：
  1.一般看家基因（如actin与GAPDH）的CT值在什么范围内比较合理，我们同学的一般经验是10-18，并且认为如果看家基因的CT值大于20，则模板浓度太稀了，结果就不可信了。是否真的如此呢？有时候反转录的cDNA浓度就是很稀，我也没办法啊==！，模板比较稀的时候得到的定量PCR结果到底可不可信？
  2.两个需要对比的样品之间，看家基因的CT值之差大于多少的时候，定量PCR的结果不太可信呢？我身边流行的说法是两个样品看家基因CT值差异大于2，结果就不可信，因为这样两份样品的浓度差异约4倍以上，完全没有可比性，事实是怎么样的呢？
  PS：以上说的问题都是在溶解曲线很好，无引物二聚体，4个孔之间重复性还比较好，不会是配样的问题时出现的，怎么样的定量结果才是可信的，违背了那些原则的结果是不可信的？
期望解答，万分感谢！

作者: INK 时间: 2014-7-29 13:11

请教大虾：

我做质粒的real-time，为什么1：最后的荧光强度比较低，一般也就在10左右，有的只有5、6？
2：为什么同样一份DNA样本重复测量几次，总是Ct值差不多比较正常，但最后荧光强度能差很大，不知是何原因？
3、我的扩增曲线不像典型的指数增长那样很快达到平台期，总是斜着上去，感觉曲线比较平，而且到40个循环也还没到平台期？我试过调整酶量和退火温度都没什么用。

多谢指教！

作者: 挖挖挖 时间: 2014-7-29 13:12

本人做过几年的定量PCR，有一定的经验。看到版里头有许多战友对定量有许多问题。愿意就定量PCR的问题与各位战友一起探讨。

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你好，我有一问题请教：
我做实时荧光定量PCR检测乙肝病毒DNA实验时，不是高含量样本；有时扩增曲线在15循环内就有抬头，后来又有一抬头。有一次4个标准中有两个也出现这种情况。不知何原因，请指教，谢谢！

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