分析测试百科

标题: 【讨论帖】引物质量直接影响PCR结果！ [打印本页]

作者: yjf1026 时间: 2014-7-29 15:05 标题: 【讨论帖】引物质量直接影响PCR结果！

在此讨论我们实验室沉痛教训，以使大家借鉴。
在2006年7月至9月22期间，本实验室委托上海生工通过济南代理合成了十几对引物，期间，我们启用了10对引物。实验室伙伴们将目的基因扩增并链接T载体后，委托合成引物同一公司测序，结果发现，10对引物中有5对引物错误:
1:少了一个碱基
2：多了两个碱基
3：错了一个碱基
4：上游引物与下游引物合成的序列完全一致（给我们丢了下游引物）。
5：出现终止密码子一对
上述错误在10对中占有50%的比例，此错误比例惊人，给我们实验室造成严重损失，不仅仅剩余的几十对引物不再敢启用，更重要的是，这半年的工作白费，浪费了人力物力，更延误了我们与某公司签订的合同期。
我们已经与上海生工进行了联系，公司副总李瑞峰经理进行了查证，生工总经理王珞珈表示了道歉。
本科室发布通牒，以后不许在上海生工合成引物，不可靠的引物会对工作造成严重损失，时间是不可挽回的！！！
谨以上述实例提醒大家：当你的PCR做的结果不可思议时，请考虑引物问题。
cuturl('http://www.microbiology-sd.cn/')

作者: kuohao17 时间: 2014-7-29 15:06

恐怖阿，不像是聚合酶错配阿。

作者: leifengta 时间: 2014-7-29 15:07

可不是一般的恐怖啊，终于有人同情我了，呜呼，我们被上海生工合成的错误引物炸的休克了啊！连续5个啊～想：PCR扩增获得目的带、连接到T载体、再转化大肠、重复PCR鉴定、测序...多少工艺啊，多少劳动和汗水，全部损失掉～不休克才怪！

作者: fsdd817 时间: 2014-7-29 15:08

好像是生工的很多产品都不成熟！

作者: tangxin_80 时间: 2014-7-29 15:09

我有同感, 我合成的一对引物P不出条带,连非特异性都没有, 多谢提醒

作者: baidukk 时间: 2014-7-29 15:10

可能是搂主的运气差些吧。
我主要在上海生工合成引物，这三年总共有差不多1万个碱基吧，其中大部分是用来做全基因合成的，觉得错的不多。一般合成500bp的基因（共需要合成1000bp的引物）挑4个测序，有2个是完全正确的。
相反，我觉得上海生工的测序要差些。10个样品通常会有3个左右测不出来（之后同样的样品，同样的引物让广州英骏就测出来了）
总体来看，我还是比较信任生工的引物合成的，测序则首选英骏。
忘了说一下，生工引物合成有的在上海，有的在北京。应该是前者好些。

作者: caihong 时间: 2014-7-29 15:11

不争吵，在我发这个帖子之前，我已经跟你们生工副总李瑞峰交涉了，他对生工的错误进行了查证，总经理王珞珈进行了口头的道歉，并已通知财务取消所有您的余款挂账。
我们在生工的帐务很少，只是对损失的半年时间感到不平！我们有来往书信，你想读吗？Pathway

[ 本帖最后由 caihong 于 2014-7-29 15:12 编辑 ]

作者: yjf1026 时间: 2014-7-29 15:12

苦啊，连续5对引物啊，你想，从设计引物，等待你合成，然后PCR扩增、连接T载体、转化大肠、提取质粒、酶切鉴定、PCR...等，最后又测序，惨重啊！！！
根据Pathway所说，可能是测序出了问题，我非常希望是测序问题！但是，无论是那个问题，都不应该啊，造成的损失太惨重了，哭～～～～啊

作者: glass 时间: 2014-7-29 15:13

顶一下，我在生工订的引物都花了一周时间了，什么都扩不出来．连非特异条带都没有．晕，我已换了大概２０多个条件，P了不下２０管什么都出不来．但我的引物跑得出条带，不知道是什么原因？现在想换家公司重新合成，大家给推荐推荐啊！

作者: yonger 时间: 2014-7-29 15:13

QUOTE:

原帖由 glass 于 2014-7-29 15:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
顶一下，我在生工订的引物都花了一周时间了，什么都扩不出来．连非特异条带都没有．晕，我已换了大概２０多个条件，P了不下２０管什么都出不来．但我的引物跑得出条带，不知道是什么原因？现在想换家公司重新合成，大家给推荐推荐啊！ ...

我用大连宝生物的引物,以前都不错,但是这次定的引物两对,都没扩出来.不知道是不是也是引物合成的问题.

作者: bling 时间: 2014-7-29 15:14

宝生物的还可以的，我以前一直用，生工上海的，还可以，只是有的时候脱盐不够好，不过总体还是不错的

作者: huifeng0516 时间: 2014-7-29 15:17

我们用的是北京奥科的，不知道，反正我做的结果不是太稳定（同样体系和条件）

作者: wood533 时间: 2014-7-29 15:17

我们用的是北京奥科的，不知道，反正我做的结果不是太稳定（同样体系和条件）

作者: mamamiya 时间: 2014-7-29 15:18

刚收到的，建议大家看看，了解一下引物合成的现状．

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&amp');id=5210950&sty=3&keywords=oligo+6

作者: shenkunjie 时间: 2014-7-29 15:18

塞百盛合成的引物还可以,我也一直用着,可以少量试试

作者: ritou1985 时间: 2014-7-29 15:22

大连宝生物的引物也不稳定，我有一次合成7管，其中6管是空白，没有任何产物。呜~~~~~~~

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&amp');id=5210950&sty=3&keywords=oligo+6

作者: yjf1026 时间: 2014-7-29 15:23

^_^，有这么多相同遭遇的朋友，再苦，也得到安慰了！！
请浏览这篇文章：《多对引物合成错误造成严重损失》cuturl('http://www.microbiology-sd.cn/bbs/context.asp?id=246')

作者: 雪花子 时间: 2014-7-29 15:23

其实有时候大家合成引物默认是5OD,我在sbs合成都是说的2~5OD,有时候就是给我5OD,有时候少一些.但是这样比较能够保证质量.

作者: tuuu2 时间: 2014-7-29 15:24

看了大家的情况，真是找到了一大堆知己啊，
我最近就是一直出现这个问题，刚开始还能扩的出来，怎么换了一批引物，就不停的出现脱尾，没有条代等情况，原来同一批的货，还有可能有不同的情况，看来要赶快换引物了，谢谢大家了，，，唉，真不知道该怎么说中国的这些试验水平

作者: yjf1026 时间: 2014-7-29 15:28

我们实验室当时选引物合成公司时，选了赛百胜、奥科、博雅三家公司。只有赛百胜是提供毛细管检测服务的，但每条收取100元的检测费，但它们公司说保证大部分的引物纯度都能达到90%以上。我们选取了6条引物同时让这三家去合成，博雅和奥科的都还可以，但是赛百胜公司给我们的6条引物却只有2条达到了标准，无奈他们只有重合，并且把重合的引物全部做毛细管检测，但可惜的重合了2、3次是最终那4条也还是没有能达到标准。我们就放弃了赛百胜。接着我们又拿了40条引物去博雅和奥科分别合成，比较两家公司的合成效果，总的说来博雅要比奥科合的效果相对好一些，有些引物博雅合成的就扩出来了，奥科合的就出不来。我们就选择了博雅合成引物。但并不是一点问题都没有，他们公司合的引物稀释后根本就存放不住，很多引物稀释保存一段时间就扩不出来了。我们也弄的很郁闷！5年前，我们的引物都是在上海生工合成的，那时候他们合的引物质量非常好，管底特别干净，无杂质沉淀，有的引物我们存放了2、3年都没有问题。可现在不行了，引物合成拿过来一看，有的引物管底脏的不行，一大团黄色沉淀，而且引物存放不住。不过，我还记得2年前我在生工用dHPLC纯化方法合成的引物效果还是相当不错的。就是价格太贵。如果不是筛选引物而是做检测什么大量用引物可以考虑用dHPLC纯化方法，或者拿到国外合。过几天我要做下实验比较一下咱们国内的引物和国外引物合成的差别。象我们现在合荧光标记引物，大量合成60OD价格与国内相差不大了，而且质量有保证，存放时间也要长1~2年。现在引物的质量对我们的实验也造成了很大的干扰。

作者: wmp1234 时间: 2014-7-29 15:29

我也常用生工的，出错一次，少一碱基，态度很好的得合了，呵呵，也是在济南。
宝生物错过一次，总P不出，仔细一看，特别粘，好象是PEG，做PAGE，发现根本没条带。这次在西安，找代理，说要检测，态度不好，于是我发火，威胁所有试剂都不付钱，马上答应重合成。
第一次在三博远志合成，结果和楼主相当，一半都有错，因是一同学作代理，不愿搞僵，便宜他们了，当然第一次也是最后一次让他们合成了。

作者: daod 时间: 2014-7-29 15:31

呵呵，今天刚给生工发了一个订单，58条引物，1342个碱基。
楼主大概是危言耸听吧。

作者: whitesheep 时间: 2014-7-29 15:36

我在英俊合成也也有很多的错误！在哪里合成能保证质量呢？

作者: 98776langtao 时间: 2014-7-29 15:37

完全同意‘贰拾面体’ 朋友提出的上海生工引物合成质量没有保证。
我认为完全有可能
因为我就曾经在上海生工处合成过一对引物，目的片段看似扩增出来，但是连入质粒测序结果显示，在上下游引物的序列有多处错误，测序也是在该公司测定，引物合成错误不说，代理商竟然还要测序费，我实验所用的试剂，自己的宝贵时间该由谁负责！！！！，还好意思要测序费！！！！所以我就告诫师弟师妹绝对不要在上海生工合成引物！！！希望我的教训能给正在做实验或者即将做实验的朋友一点提醒，不要因为这些问题浪费我们的宝贵时间，毕竟我们要在有限的时间内，作出东西好毕业！！

作者: 小糖块 时间: 2014-7-29 15:37

上海生工的引物是有问题的，我做了克隆一直不表达蛋白，后来一测，一端少了一的ATG的A，一端TAC的C变成了G，啊，我半年的时间就这样浪费了，因为引物合成时间较长，就没有和他们计较了，现在我们实验室都　不从上海生工订任何东东了，态度差，质量不行的公司能生存吗？

作者: yonger 时间: 2014-7-29 15:38

上海生工的引物是有问题的，我做了克隆一直不表达蛋白，后来一测，一端少了一的ATG的A，一端TAC的C变成了G，啊，我半年的时间就这样浪费了，因为引物合成时间较长，就没有和他们计较了，现在我们实验室都　不从上海生工订任何东东了，态度差，质量不行的公司能生存吗？

作者: yonger 时间: 2014-7-29 15:39

上海生工的引物是有问题的，我做了克隆一直不表达蛋白，后来一测，一端少了一的ATG的A，一端TAC的C变成了G，啊，我半年的时间就这样浪费了，因为引物合成时间较长，就没有和他们计较了，现在我们实验室都　不从上海生工订任何东东了，态度差，质量不行的公司能生存吗？

作者: kuohao17 时间: 2014-7-29 15:39

02年时做实验用了一家公司的引物,花费了我2个多月时间,其他的各种资源耗费先放在一边不谈,关键是让带我的老师对我产生了不信任,认为我是要走的人了,不好好做实验了.事实完全不是这样的,当时我一心想把活干得漂漂亮亮,走的开开心心和心安理得.总之离开单位时总有一些别扭.之后换了个同学从新开始做,搭进去了3个月时间,但没有丝毫进展.再找遍所有可能出错的原因后,真凶浮出水面,就是引物合成出了差错,少了一个碱基.害人不浅,人力\物力\信誉,引物之毒害可见一斑.时间过去有将近5年了,这种歪风邪气依然横行,呜呼哀哉,让我辈甚感失望.看来这个市场不肃杀一批假冒伪略是不行的.

呼吁园子里的各位同仁坚决抵制和打压伪略产品的市场生存空间,让这个市场真正规范起来,借用一句广告词:大家好才是真的好.呼吁大家都出一份力,不让悲剧一次次的重新上演.

作者: yhz1973 时间: 2014-7-29 15:40

我也出现过同样的引物错误，当时是在博亚，现在的英骏，不过出现问题后公司虽然重新合成，当时浪费了很多时间，这个是无法挽回的

希望公司能引起重视
如果事情大一点，公司肯定还会重视
记得上海的一个博士还做很多同位素，最后发现是引物问题，白白的被辐射了好几个月

作者: zsxan1990 时间: 2014-7-29 15:40

目前质量最有保障的方法是质谱检测，你可以清楚地看到你的引物中有多少有碱基缺失，多少有碱基错配。次一点的，可以选择毛细管电泳检测。
ecnusmmu，引物的浓度和质量不能用琼脂糖电泳来检测（不知道你是不是这样检测的），因为琼脂糖EB染色检测的是双链DNA，只有在引物形成二级结构的情况下才能看到，所以不同引物形成二级结构数量不同，染色观察到的浓度就大不相同。

作者: zsxan1990 时间: 2014-7-29 15:41

我觉得表达蛋白之前先做测序，比较保险，还是比较常规的思路。在起始密码字的位置出错的，有很多，很致命。
最后，在引物中发现错误是必然会有的，哪家公司都是，只是比例高低的问题，遗憾的是，现在国内公司合成引物的纯度越来越低了，所以测序发现错误的也越来越多。也许有的同学会发现换一家公司就好了，其实说不定哪一批引物也碰到质量问题，这其实就是个概率问题。当然，有时候某一批引物质量特别差，就会出现楼主所说的问题。
建议：如果急着出实验结果，连接转化完之后直接挑2－3个克隆去测序，不要去跟公司讨论什么测序费用谁出的问题了，没用的，现在国内引物合成的现状就这样。多挑几个测序，看似花钱多，实际上后面省心很多。如果是长引物（60bases左右），首先特别不建议合成，实在没办法，那就只有多挑克隆，挑上四五个才找到正确的是很平常的事情。

作者: c86v 时间: 2014-7-29 15:42

生工真是害死人呀！

偶以前也一直在生工合成引物，但今年9月份左右出事后就再也不去他们那边了。那次是我合成了4条引物，然后回来就是p呀，连接什么的，等测序时才发现给我错了两条。其中一条是多了一个碱基，另一条错误的是一个碱基突变。为了证明是他们家合成出错，我又换了家测序，结果还是如此，哭呀！！

跟他们吵了半天，最后索赔的结果是重新合成序列，并赔我在那里6次测序～～～不过想想这其中浪费的时间和精力，至今仍是耿耿于怀！

作者: 8princess8 时间: 2014-7-29 15:42

不是吧，我一直都用上海生工的引物，本试验室还有其他人用英骏的引物，但也没听人说生工的东西这么经不起考验阿。我们做不出来的时候一般都怀疑引物设计的问题而重新设计引物，从来都没有考虑是它们合成出了差错。如果真是楼主所说这样，那真是很恐怖额

作者: 89tongzijun 时间: 2014-7-29 15:42

请问合成引物一定要测序吗?设计引物和测序是什么关系....我不大明白这方面的.正在困惑中.

如果我想做RT-PCR,是要自己设计引物吗?那测序是什么?

原来还想用生工合成呢,现在有点怕喽.

请大侠们指点.多谢了!

作者: summerxx 时间: 2014-7-29 15:43

我是个新手，我也在上海生工合成了引物，现在刚开始做PCR，做了三次现在还是没有结果，我听了你们的话我都吓死了，会不会我的引物也会有问题啊，我怎么知道自己的引物是不是有问题啊？哪位高手指导一下啊，我都急死了。

作者: bling 时间: 2014-7-29 15:43

我还想问问楼上的高手一个问题。我用的引物是国外很多个人都用过的，用的条件也是他们用的。可是就是扩不出来，他们文章中提到用的退火温度是70度，我今天做了一个61－70的梯度，可是还是不行。我想问问你们觉得是什么因素影响了结果啊？

作者: redbutterfly 时间: 2014-7-29 15:44

看来，生工在订货单上保证的所谓错误率低于多少，根本就是做不到。我以为我是孤独的，看来，跟我一样遭遇的朋友很多很多。越是老手，越是能发现问题。我的网站：山东省医学科学院基础医学研究所微生物室

作者: fei1226com 时间: 2014-7-29 15:45

我以前也是用的上海生工的引物，做也做出结果出来了，但是到后面就结果越来越差，就扩不出来了，这个我个人认为还是其保存时间不够久的问题，但是还是可以做出东西出来的，不像楼主所说的那么恐怖，但是现在我换了博尚公司的引物，先是没有做出来，后来用别人的引物才发现是引物的问题，他们又重新给我合成，但是后来重新合成还是什么东西都没有，这难道又是引物的问题？我都快要欲哭无泪了，搞了好久都没有搞出来，做一个简单的PCR都搞这么久，搞得老板极不耐烦了，但是我有什么办法？真的是晕！！

作者: dog002 时间: 2014-7-29 15:45

其实，看了楼上的发言，引物合成回来好像都没有核对，就开始做试验了。我是有教训的，反复做了近一个月，结果总是不理想，最后发现是引物序列出了问题。所以，以后做试验，都要认真核对引物序列，标出引物在DNA序列中的位置及PCR产物的大小，这样做试验心里才有数，便于以后分析原因，节省时间。虽然核对的过程很单调，有时眼睛都要看痛，但对自己负责嘛，还是值得的。

作者: ending 时间: 2014-7-29 15:46

最近我们用了生工以外的引物效果不错。我们相信偶然，可是如果错误率在一个试验室高达40～50％，就不是偶然了，生工引物暂缓使用了，等他们整顿过后再用

作者: yhz1973 时间: 2014-7-29 15:46

请问：如果之前没有做PCR的经验，由于课题需要测定受体含量，而放射配基结合法本地区又测不了，自己用PCR测受体的mRNA，会不会太冒险，因为时间和经费都是很有限的.
望大侠们指教！！多谢！！

作者: greenbee 时间: 2014-7-29 15:46

如果熟练，又引物质量首先保障，测定MRNA的表达是可以说明一定问题的，但是，不能在生工合成引物，而且正如楼上很多朋友讲的首先验证引物。
还有，RNA提取过程不简单，生手有时候什么也提不到。不过，如果有操作其他试验的经验，提取RNA还是不成问题的。有的老手不用DEPC处理品都能提到并P的很好（当然速度重要）。

作者: utt0989 时间: 2014-7-29 15:47

测序发现上下游引物完全一致，应该不怪人家生工，扩增条件调整不好的情况下，会出现只有单引物扩增条带，这是我们实验室经常出现的问题，你应该做上下游单引物扩增的对照。

作者: okhaha 时间: 2014-7-29 15:48

生工的引物，我用了还没有发现什么问题，但是去年暑假的时候真的是把我们害死了，DNTP有大问题，用做RT一直不出，因为同样的DNTP做PCR却没有问题，所以一直没有怀疑它，一偶然的机会换了DNTP做RT，就出来了。三个月，实验室做需要反转录的病毒的都没有任何进展。所以，我们现在也很少用他们的东西了。
其实，人力和财力不是最重要的，时间才是浪费不起的。

作者: zhezhe 时间: 2014-7-29 15:48

上游和下游引物一样的原因，是生工的代理在发送E-mail的时候，将引物复制错误了，呵呵，不是我们自己的原因。我的网站在百度搜索“生工引物”，出现的第二个主题就是我的网站，我的网站有更加详细的内容。

作者: zhenxin 时间: 2014-7-29 15:49

非常同意你的观点，金钱是次要的，时间才是最重要的！！如果不是这样，我怎么能放过生工给我造成的损失！我怎么能放弃索赔！他们的总工王珈璐在E-mail对我们不索赔表示了赞赏和感谢，可是，他们不了解，我索赔的内容他们没有办法赔偿，因为我要求赔偿时间！！！
呵呵....我宽容吗？不要金钱赔偿就是宽容吗？虽然没有索赔金钱，可我心里到现在对我损失的时间耿耿于怀！
我的网站：在百度搜索“生工引物”，第二个主题就是我的网站BBS。我也有首页的。我们微生物室做了自己的网站，并且希望将网站做成业内人员经常光顾的家。

作者: tie8 时间: 2014-7-29 15:49

都会出错，我该怎么选？已经错了一次，我能相信错误的概率已经过去了吗？公司出错几率越大我们碰上的机会就越多，哪个公司的几率更大呢？光看出错的例数是不能说明问题的，那我怎么来比较呢？

没有办法，就用楼上的办法吧，都订了试试，实在是耽误不起这时间了呀

运气啊。运气好的话，即使只有1%的正确几率，碰上了，那就是百分百，一切顺利，万事大吉；运气不好，0.1%的错误，碰上了，时间，金钱，精力，名誉，自信心..........任何赔偿相对于损害都是九牛一毛

作者: eve_49 时间: 2014-7-29 15:50

你的思想非常有代表性。最初，我遇到生工引物第一对错误的时候，想，错误是难免的，既然这次错了，从统计学角度出发，下次一定是正确的，万万没有想到的是，我竟然接连几次都是错误的，错误率占我启用引物的40％（16对引物中，启用10对，错误4对）。
上述内容不能不让任思考，引物的错误与选用的公司相关。
最近，我们公司用了伯亚的，幸运，21对中还没有错误出现........
其实出现1～2次错误我们是可以忍受的，我们不是不讲道理的用户，我们还是非常体谅公司的难处的。在我的网站，我就粘贴了申能合成引物的问题讨论，部分内容诉说了公司合成引物的无奈。

作者: toy 时间: 2014-7-29 15:50

其实，看了楼上的发言，引物合成回来好像都没有核对，就开始做试验了。我是有教训的，反复做了近一个月，结果总是不理想，最后发现是引物序列出了问题。所以，以后做试验，都要认真核对引物序列，标出引物在DNA序列中的位置及PCR产物的大小，这样做试验心里才有数，便于以后分析原因，节省时间。虽然核对的过程很单调，有时眼睛都要看痛，但对自己负责嘛，还是值得的。

==================

怎样核对引物呢？

作者: dog002 时间: 2014-7-29 15:51

半年前在生工合成一对引物，少了一个碱基（测序结果显示）
前不久在上海英骏合成了一对引物，测序结果（在英骏测序）显示也少了一个碱基
不知道是相信英骏的引物合成还是它的测序，郁闷～～～～～
实验都不敢往下做了

作者: vivian4123 时间: 2014-7-29 16:33

我们实验室一直是在生工合成引物啊，有时引物不好用，再重新合一次，没有想到他们公司的错误率会如此之高啊

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)