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标题: 【转载】【讨论帖】snp、测序问题专贴 [打印本页]
作者: sunbent    时间: 2014-7-29 16:38     标题: 【转载】【讨论帖】snp、测序问题专贴

为方便大家提出和回答问题
特开辟本贴，希望大家支持。
作者: jujuba    时间: 2014-7-29 16:43


我的目的基因片段连到载体上后 为什么测序时目的基因片段出现碱基丢失啊 最多的一个少了有10几个碱基 我的cdna模板应该没问题的，请教这是什么原因？要从哪些方面考虑 谢谢啊
作者: tuuu2    时间: 2014-7-29 16:44


一般丢失掉是在那一段
你的载体序列是否完整，还有你插入了多大片断？
作者: fsdd817    时间: 2014-7-29 16:44


我送了三个重组质粒测序，有一个是目的基因的中段丢失了10几个碱基，另外两个是在目的基因的两端出现碱基丢失，不过只是丢失一两个碱基。我插入的片段有900多bp，我用的是pcDNA3.1载体，怎么判断载体序列是否完整啊？
作者: yueban-1147    时间: 2014-7-29 16:52


1、载体的完整性就是你直接去处载体序列，2端都会有的
2、中间那个地方的得改变你看一下测序质量，如果好就只那样
3、2端的有可能实测序的问题
最好在测序验证
作者: ROSE李    时间: 2014-7-29 16:53

请问snp位点找到了，但是在哪儿可以查到内切酶，怎么查
作者: dog002    时间: 2014-7-29 16:58

我把质粒给公司重新测了一下 结果还是和之前一样 看来只能重新做了。。。唉
作者: huifeng0516    时间: 2014-7-29 16:58

请问snp位点找到了，但是在哪儿可以查到内切酶，怎么查

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好久没做了一起那是用的dnastar上的酶切
作者: wmp1234    时间: 2014-7-29 16:59


各位大侠：问一下 测序可以测出550-600bp 没问题吧，两端多少bp测不出啊，如果我想看的点在末端54bp，可以测出来吗，
作者: baidukk    时间: 2014-7-29 17:00


前面100后面50基本上是低质量区
做基因组还勉强可以用，找snp肯定不行
作者: yueban-1147    时间: 2014-7-29 17:00

请问snp位点找到了，但是在哪儿可以查到内切酶，怎么查
请教，怎么寻找SNP位点，需要做那些工作呢？
作者: sunbent    时间: 2014-7-29 17:01



QUOTE:
原帖由 yueban-1147 于 2014-7-29 17:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问snp位点找到了，但是在哪儿可以查到内切酶，怎么查
请教，怎么寻找SNP位点，需要做那些工作呢？


你可以参考此贴：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&amp');id=11164794&sty=3&keywords=watcut+%C3%B8%C7%D0
作者: birdfish    时间: 2014-7-29 17:01

请教，怎么寻找SNP位点，需要做那些工作呢？
作者: mysmdbl    时间: 2014-7-29 17:03


你是要根据基因还是根据疾病？
作者: toy    时间: 2014-7-29 17:12


你好，我的目的片段分别为129bp和170bp，我是做RFLP验证SNP位点。我直接拿pcr产物测序时说片段太小，测不出来，有什么方法可以检测出片段呢？
作者: duoduo    时间: 2014-7-29 17:14

根据snp为点直接作pcr建议长度在
400-500bp
作者: qqq111    时间: 2014-7-29 17:15

1、在文献中看到，对同一个基因，不同的人会用不同的微卫星标记（STR），一个候选基因的STR会有多少，按要做连锁来说，选择的STR越接近候选基因越好。请问我怎样才能选到候选基因附近的STR做连锁呢？一个候选基因一般选几个候选基因好。
2、按您的做法，我在UCSC中查找RHO基因，跳出的界面（cuturl('http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?position=chr3:130730172-130736877&amp');hgsid=114279453&knownGene=pack&hgFind.matches=uc003emt.1,）有很多的rs号，可没看到STR号。
3、本人也在NCBI MapViewer上点击相应的染色体号（如3号染色体），跳出的图中并没有Marker，而在此（NCBI MapViewer）检索界面输进 D3S3606时就有Marker号，但有很多文献报道都没有的，要直接输进文献中STR号找才行。命名也很多不同（如SHGC-148920，WIAF-2146），文献中多用D?S?形式。
4、所以,还是再次请问：应该如何去找到某一基因（如RHO，3q22.1 ）附近的STR呢，本人新手正想做连锁分析，还望各位前辈包容这就话题～希望各位前辈赐教，不胜感激，热切期待中～
作者: utt0989    时间: 2014-7-29 17:18

1、str不是在snp数据库，一般都在dcode数据库或sts数据库，你要选sts
2、你那个区域选择只有6k，太小了，一般str间距都比较大，你改成100k-1m看看吧

我建议你好好研究一下不同物理和遗传图谱的作用，有很大好处
cuturl('http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks')
这个是修改过的
附件是以前我作夜盲时找的
作者: idea2011    时间: 2014-7-29 17:19

根据snp为点直接作pcr建议长度在
400-500bp

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我根据一篇文献选取的，RFLP已经做完发现测序验证有困难，现在还有补救的方法么？重新选扩增片段意味着全部重做，工作量太大了
作者: any333    时间: 2014-7-29 17:19

你的片断多大
可以在pcr引物内侧1-20bp
在设计一个测序引物，pcr产物回收时
注意丢失的情况，应该可以有改善
作者: sunbent    时间: 2014-7-29 17:20

请问snp位点找到了，但是在哪儿可以查到内切酶，怎么查
请教，怎么寻找SNP位点，需要做那些工作呢？

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你可以试试SNPBrowser这个软件。另外，为什么还要用RFLP这么古老的方法呀。你可以考虑试试其他方法，比如飞行时间之谱（MALDI-TOF），snplex等等。不过用什么方法还是主要取决于你的试验目的。
作者: nn255    时间: 2014-7-29 17:20


你们都叫哪个公司帮你克隆测序的？只提供pcr产物，要求克隆、测序，哪个公司比较好，什么价？
作者: ladyhuahua    时间: 2014-7-29 17:20

小弟问一个比较菜的问题，我想做一个基因KLOTHO的SNP 但是我在PUBMED的SNP查询上，没见有结果，或者是只有动物的SNP结果，没有人的SNP结果，这是怎么回事，可我看见有的论文做过关于这个基因的SNP啊，这是怎么回事，是不是我就不能做这个基因的SNP了？

还有，我查询另一个基因的SNP人类的有72个结果，我应该确定几个作为我的备选呢，如何确定呢？

谢谢……
作者: kuohao17    时间: 2014-7-29 17:21


请问一般测序的序列都很准确嘛？
我的是1000以内的
作者: summerxx    时间: 2014-7-29 17:21

终于等到高手了。我刚去国外的实验室学习，这两周都测序失败，很沮丧，时间很快啊，语言又不好...我做的六个标本，均是转导到质粒，miniprep后酶切正常，用m13通用引物双向测的。只出来了一个f，还短，其他的都是nnnnnn。
作者: gogo    时间: 2014-7-29 17:22


前50后100基本上会有很高的出错率
其它位置只要没有结构信噪比好没问题
作者: xyw5    时间: 2014-7-29 17:22

终于等到高手了。我刚去国外的实验室学习，这两周都测序失败，很沮丧，时间很快啊，语言又不好...我做的六个标本，均是转导到质粒，miniprep后酶切正常，用m13通用引物双向测的。只出来了一个f，还短，其他的都是nnnnnn。


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这个我看一下，你的载体是什么 你可以自己拿序列做一下blast
如果都是载体，应该是小片段污染 是pcr产物片段马？
作者: sunbent    时间: 2014-7-29 17:23

这个我看一下，你的载体是什么 你可以自己拿序列做一下blast
如果都是载体，应该是小片段污染 是pcr产物片段马？

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my answer: 1.my vector is pgem-t easy 2. blast result 96%, but it is short.
作者: yychen    时间: 2014-7-29 17:24

小弟问一个比较菜的问题，我想做一个基因KLOTHO的SNP 但是我在PUBMED的SNP查询上，没见有结果，或者是只有动物的SNP结果，没有人的SNP结果，这是怎么回事，可我看见有的论文做过关于这个基因的SNP啊，这是怎么回事，是不是我就不能做这个基因的SNP了？

还有，我查询另一个基因的SNP人类的有72个结果，我应该确定几个作为我的备选呢，如何确定呢？

谢谢……

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不能参照别的物种或人种的snp信息，差别会很大的
你只能去cuturl('www.hapmap.org')去找这个基因chb（中国北京汉族）的 tagsnp
来作为备选
作者: sunbent    时间: 2014-7-29 17:24



QUOTE:
原帖由 sunbent 于 2014-7-29 17:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
这个我看一下，你的载体是什么 你可以自己拿序列做一下blast
如果都是载体，应该是小片段污染 是pcr产物片段马？

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my answer: 1.my vector is pgem-t easy 2. b ...

你pcr建议切胶纯化
作者: fei1226com    时间: 2014-7-29 17:24

你好。
      我上周将PCR的产物纯化以后给生物公司测序，结果他们测出来的序列我到网上比对不是我做的物种，而是我们教研室其他同学做的物种。是不是我在回收的过程中污染了呢，还是提取DNA的时候就污染了呢。
      我提取的试剂和实验用的移液器都是自己用的。除了切胶回收的时候大家是一起用的一个板子。
      麻烦你帮我分析一下原因，我以为自己测完序就能写论文毕业了，现在出现这种情况，急啊。
      在线等答案，谢谢楼主。
作者: sunbent    时间: 2014-7-29 17:25

最有可能使他们编号错误
我建议让他们重做
污染的可能性有，但比较少
还是在编号改名的情况多见
作者: sunbent    时间: 2014-7-29 17:25

有没有可能就是生物公司测不出来，完了随便拿一个测序的结果给你呢
作者: vcve    时间: 2014-7-29 17:26

你pcr建议切胶纯化

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您是指的RT-PCR得到目的DNA的那一步吗?我是跑胶，切胶，纯化后再接载体的。1.现在测序的图上看是因为套峰所以判断为纯度不够所致吗？我的质粒的260/280在1.8左右啊还不行吗？2. 还有可能是其他的什么原因吗？
作者: sunbent    时间: 2014-7-29 17:26

小弟问一个比较菜的问题，我想做一个基因KLOTHO的SNP 但是我在PUBMED的SNP查询上，没见有结果，或者是只有动物的SNP结果，没有人的SNP结果，这是怎么回事，可我看见有的论文做过关于这个基因的SNP啊，这是怎么回事，是不是我就不能做这个基因的SNP了？

还有，我查询另一个基因的SNP人类的有72个结果，我应该确定几个作为我的备选呢，如何确定呢？

谢谢……

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你在NCBI上是查的基因符号是 kl吗？ 你看看是不是这个网址：
cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?chooseRs=all&amp');locusId=9365&mrna=NM_004795.2&ctg=NT_024524.13&prot=NP_004786.2&orien=forward&refresh=refresh
作者: duoduo    时间: 2014-7-29 17:27

请教一下，我现在在做宫颈癌相关基因的SNP，标本是用的是宫颈癌组织，但大部分文献上用的标本是人外周血，想问下，现在SNP使用外周血是基于什么原则，我现在所用标本会不会影响实验结果，对实验合理性有什么影响？谢谢，
作者: wu11998866    时间: 2014-7-29 17:27

外周血就是人本来有的啊，就是遗传的，但是组织就有可能是局部突变的。也就是后天的因素了。这里有个例子，供你参考：非小细胞肺癌，EGFR等基因在组织中的突变类型跟后期用药的效果是相关的，检测病变组织中EGFR等基因的情况可以指导用药。但是外周血中的SNP等信息可能可以来预测单独个体的肺癌的可能，就是遗传上的倾向。
作者: fox_79    时间: 2014-7-29 17:27

请教一下，我现在在做宫颈癌相关基因的SNP，标本是用的是宫颈癌组织，但大部分文献上用的标本是人外周血，想问下，现在SNP使用外周血是基于什么原则，我现在所用标本会不会影响实验结果，对实验合理性有什么影响？谢谢，

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要找的snp都可以使用正常组织和血液
没有什么区别的
作者: fox_79    时间: 2014-7-29 17:28

各位帮忙分析一下，为什么我的测序结果是这样，第一次正向测的，感觉图很乱，有反向测乐，结果还是很乱，

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这个是由于你的pcr产物太短
纯化不够干净，有pcr的双向引物和二聚体
残留，干扰测序引物 建议设计特意的测序引物
作者: sunbent    时间: 2014-7-29 17:28

哦，还有，我这个测序图89 bp的A 峰为什么那么低，结果准确吗，因为我做的酶切结果正好相反，酶切结果跑胶后很明显，所以矛盾，郁闷阿  ，谢谢，问题太多，我是新手，时间有限，烦。。。。。。

那地方就是应该是a，太低时由于

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两侧c 峰的波长干扰，也就是c峰还没有
衰减完a峰就出现了，计算机计算重建的时候
a峰的部分荧光值被错误的认为是前一个c峰的
就会这样
作者: ffaa    时间: 2014-7-29 17:29


如果和你以前的实验矛盾
建议反向测序就没这样的了
作者: is2011    时间: 2014-7-29 17:30

您是指的RT-PCR得到目的DNA的那一步吗?我是跑胶，切胶，纯化后再接载体的。1.现在测序的图上看是因为套峰所以判断为纯度不够所致吗？我的质粒的260/280在1.8左右啊还不行吗？2. 还有可能是其他的什么原因吗？

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不是纯度问题
是感觉你转进去的都是pcr的小片段
不是你的目的产物
这样是靠od无法判断的
只能把转好的质粒加空载一起电泳
看你插入的片段多大
作者: jrwyyplt    时间: 2014-7-29 17:31


我想问下楼主如果用二次PCR产物直接纯化测序这样的结果可靠吗
作者: wsll    时间: 2014-7-29 17:32

2次pcr可能会产生非特异性扩增
不仅会有非特异性条带，有时主带也是非特异性的
可以测序，但要看电泳结果，测序后要比对你的结果
看是不是你所需要的
作者: finger    时间: 2014-7-29 17:32

可以啊，一般的酶的错误率是很低很低的，没有关系的，临床检测上也有两次PCR的产品。可以的
作者: kulee    时间: 2014-7-29 17:33


可以啊，一般的酶的错误率是很低很低的，没有关系的，临床检测上也有两次PCR的产品。可以的
作者: greenbee    时间: 2014-7-29 17:33


个人认为这不是模扳量问题
他的原始run data并不是很高
而且一直比较平稳没有出现急剧下降的情况
2侧的荧光信号质量都很好，没有迹象表明是
模扳过大
作者: kuaizige    时间: 2014-7-29 17:33


用PCR的方法提取了目的基因，连接到T载体后在大肠杆菌内转化，菌落PCR可以扩增出目的片段，再选择PCR阳性的菌落提取质粒，再进行PCR验证阳性。送去联合基因测序，说杂峰太多，没结果。请各位帮忙分析下，是怎么回事。苦了好几个月了，又是一场空啊。
作者: nut6694    时间: 2014-7-29 17:34


不是看峰高低的，要看信号的高低的，都1000以上了
作者: sunbent    时间: 2014-7-29 17:34

用PCR的方法提取了目的基因，连接到T载体后在大肠杆菌内转化，菌落PCR可以扩增出目的片段，再选择PCR阳性的菌落提取质粒，再进行PCR验证阳性。送去联合基因测序，说杂峰太多，没结果。请各位帮忙分析下，是怎么回事。苦了好几个月了，又是一场空啊。

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这关键在于质量提取以后dna德模扳量
不知道你们是否跑电泳或者定过量
作者: sunbent    时间: 2014-7-29 17:35

不是看峰高低的，要看信号的高低的，都1000以上了

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信号只是一方面，但不能只重信号来看
，测序的峰高其实是反映模板和引物的配比情况
也就是反应效率，模扳量多一般指和引物相对，而且
只要是bigdye对于模板和引物有比较高的要求，pcr测序
模板控制在30-100ng引物在1-10pm，质粒测序控制在50-300ng
引物1-5pm最好
作者: sunbent    时间: 2014-7-29 17:35

这关键在于质量提取以后dna德模扳量
不知道你们是否跑电泳或者定过量

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你好，每次胶回收后都再跑一次电泳来看看条带亮度的。每次的亮度都还不错的。
作者: yueban-1147    时间: 2014-7-29 17:35

那你和他们测序地说
比较亮，建议稀释一下
作测序，还有最好把你测序结果的原始
峰图发上来看看
作者: flower-201    时间: 2014-7-29 17:36


请教楼主，四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应(tet ra2 primer amplification ref ractory mutation system polymerase chain reaction ,tetra-primer ARMS-PCR)检测已知的SNP效果如何？老外承认这种方法吗？谢谢
作者: sunbent    时间: 2014-7-29 17:36

这个有一段时间很多人做
但随着新技术的发展，这种方法的假阳性和
不好判断就造成用的人越来越少了，我认为技术过硬
还是没问题的，但要测序验证
作者: xue258    时间: 2014-7-29 17:36

我有两个片段拿去生工测序,分析后发现其中一个有两个碱基发生了变异,并且氨基酸也变了,分别是在47位由苏氨酸变为丙氨酸，在69位由赖氨酸变为精氨酸。.另一个片段也变异了一个碱基,且氨基酸也变了，在第7位由甘氨酸变为谷氨酸.不知道这样对后面的实验影响大不大呢?
作者: sunbent    时间: 2014-7-29 17:37

我有两个片段拿去生工测序,分析后发现其中一个有两个碱基发生了变异,并且氨基酸也变了,分别是在47位由苏氨酸变为丙氨酸，在69位由赖氨酸变为精氨酸。.另一个片段也变异了一个碱基,且氨基酸也变了，在第7位由甘氨酸变为谷氨酸.不知道这样对后面的实验影响大不大呢?

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1、方便把你的原始文件放上来看一下吗，这样说
不能确定是不是真的突变
2、你的试验目的是什么，你没说清楚没法评估
作者: fsdd817    时间: 2014-7-29 17:37

请高手赐教：我想扩一段长约３３００ｂｐ的ＤＮＡ启动子区，结果在设计引物时遇到了麻烦，恰好在启动子区时，引物的非特异性条带很多，若引物设计评分比较高时，扩的条带大概得３６００左右，不知用哪个引物更好些？潮式ＰＣＲ可以解决这个问题吗？
作者: sunbent    时间: 2014-7-29 17:38



QUOTE:
原帖由 fsdd817 于 2014-7-29 17:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请高手赐教：我想扩一段长约３３００ｂｐ的ＤＮＡ启动子区，结果在设计引物时遇到了麻烦，恰好在启动子区时，引物的非特异性条带很多，若引物设计评分比较高时，扩的条带大概得３６００左右，不知用哪个引物更好些？潮式ＰＣＲ可以解决这个问题吗？
...


你接下来要做什么
你已经用引物做过试验了吗
非特异性扩增的问题很难解决，在考虑换引物
巢式pcr在非特异扩增上没有梯度有效
作者: qianqin1977    时间: 2014-7-29 17:38

请高手指点，k-ras基因的SNP与疾病的相关性研究还有意义吗？如有，有那些切入点，谢谢！
作者: sunbent    时间: 2014-7-29 17:39



QUOTE:
原帖由 qianqin1977 于 2014-7-29 17:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请高手指点，k-ras基因的SNP与疾病的相关性研究还有意义吗？如有，有那些切入点，谢谢！

有一定的意义，关键看你怎么看待这个基因
现在冲遗传的角度，可以考虑这个基因的突变对于
肿瘤发生的影响，也可以考虑作为生物学标志物评价
肿瘤的预后，至于基因本身的功能作用，单纯用snp来做
就有点困难了，应该联合基因的表达调控
作者: moonlight45    时间: 2014-7-29 17:39

请高手指点一下，我做的是一个玉米cDNA片段，而我的测序结果，和我的目的片段不符合。
我NCBI上blast了一下，相似最高的是Cloning vector pJG4-5 (pB42AD), complete sequence。和Cloning vector pEZY45, complete sequence。
不知道怎么回事。
是不是cDNA模板污染了呢。
我当初扩PCR是扩了好多次才出来条带。
用pmd18-t连接转化，PCR鉴定没用通用引物。
阳性的测序。
测出的结果却是这样的。
作者: PINK    时间: 2014-7-29 17:40

很有可能
是你转化的时候绝大多数阳性克隆
都是pcr产物中的小片段
，不是你要的片段
你可以把你的质粒dna和空载dna一起跑一下
电泳，看一下是不是有完整的插入片段
作者: tudou85    时间: 2014-7-29 17:40


不同标本相同PCR产物的测序图会一致吗？包括背景峰？

说正题吧：我在做一批病人标本的基因扩增，通过测序寻找可能的突变，今天受到的结果发现某些不同标本的测序彩图峰竟然出奇的一致，详见附件。我测得基因在X
染色体上，男性，按理说不可能出现杂合现象！我要求用的是胶回收纯化，按理说背景峰应该很小！请问：
1.这些十分相似的峰对于不同标本可能出现吗？
2.会不会是他用一个图给我修改的？骗我？
3.同一个标本如果先后测序2次，得到的峰型会一致吗？

先谢谢了！
作者: 131415    时间: 2014-7-29 17:40

1、你必须和他们要测序的原始文件，这种图像文件不能说明什么
有些图是很相似，但没有原始文件我也不能说就是造假
2、如果测序作得很好，有可能大致上很相同，但细节绝对不一样
这个不会出现2个完全一样的峰图
3、一个样本测2次如果反应作的好，峰型大致是一样的
作者: 49888    时间: 2014-7-29 17:41

我有个问题想请教一下高手，我扩增一个病毒的全基因（M、NS、NP。。。。），但是有个别基因片段扩增了很多次了就是不出或者条带弱到无法回收做测序用，想问一下原因？ 谢谢
作者: zhezhe    时间: 2014-7-29 17:41

你引物自己设计的还是找的
这个原因很多不太好说
作者: xiaoxiaoniao    时间: 2014-7-29 17:42

其他样品都能PCR扩增出来，就是个别的病毒有扩增不出或者很弱的条带的现象
作者: xyw5    时间: 2014-7-29 17:42

我的pcr产物126bp，被内切酶切开的几率不到10%，这试验可以做下去吗？我切了十几例都还没有切开
作者: 小野花    时间: 2014-7-29 17:42

你那个区域变异有多大
你是要找变异区变异位点？
这种情况最多见得就是高变区变化
比较大，只能多设计组合引物
还有就是那你最靠近的pcr产物去做
测序，然后采用末端延伸的方法，把这段
测出来
作者: lxh031    时间: 2014-7-29 17:43


我想做一个已知基因的 SNP 鉴定，用来检测此基因的单双等位基因表达状况，请问我该选择哪种方法？测序要测很多样吗？大概得花多少钱啊？比较弱，见笑了！
作者: sunbent    时间: 2014-7-29 17:43



QUOTE:
原帖由 lxh031 于 2014-7-29 17:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我想做一个已知基因的 SNP 鉴定，用来检测此基因的单双等位基因表达状况，请问我该选择哪种方法？测序要测很多样吗？大概得花多少钱啊？比较弱，见笑了！ ...


你是要做不同突变的表达情况吗？
不知道你们做了表达的数据没有，还有是基因多大
一般这样要对基因的启动子区、调控区和外显子区整体
重测序
作者: luoliqiong    时间: 2014-7-29 17:44



QUOTE:
原帖由 sunbent 于 2014-7-29 17:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


你是要做不同突变的表达情况吗？
不知道你们做了表达的数据没有，还有是基因多大
一般这样要对基因的启动子区、调控区和外显子区整体
重测序 ...


我要检测印记基因的单双等位表达状态
还没做表达，基因全长大概四五十万bp，
全长测序啊？？
作者: ero11    时间: 2014-7-29 17:44

400-500k的基因不算大
你看看它的编码区有多大
先测编码区和启动子区
作者: avi317    时间: 2014-7-29 17:45

400-500k的基因不算大
你看看它的编码区有多大
先测编码区和启动子区

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回到我的问题, 你是说我直接测序找杂合子吗 ?就靠测序的方法就可以检测基因的单双等位表达? 不好意思, 关于SNP 还不是很明白,看有人通过RFLP,,SSCP来检测基因的表达状态, 还得看看文献啊
作者: avi317    时间: 2014-7-29 17:45

还是没明白你说的单双表达的意思
你是要提取ran，然后测cdna吗？
作者: sunbent    时间: 2014-7-29 17:46

检测组织中某印记基因是父系表达还是母系表达，抑或双等位表达
我还不清楚该用什么方法做
作者: jkobn    时间: 2014-7-29 17:46


这个如果有家系或是核心家系应该可以解决
作者: tangxin_80    时间: 2014-7-29 17:47

国外相关的报道文献有吗
你们有什么组织？
作者: ROSE李    时间: 2014-7-29 17:47

我是一个新手，想问一下我手头已有提好的血标本的DNA，要测某个基因的SNP位点，想用酶切的方法做。想请教一下，我一共要准备哪些试剂，怕到时东西不全，实验时间会影响，谢谢哪位高手指导！
作者: mimili_901    时间: 2014-7-29 17:47

你先去找找这个位点用那个切酶
可以多看几个网站
然后选择酶，常规应该有国产和进口的
在就是pcr的试剂，如果没做过实验建议用mix
作者: windy+++    时间: 2014-7-29 17:48

我是一个新手，想问一下我手头已有提好的血标本的DNA，要测某个基因的SNP位点，想用酶切的方法做。想请教一下，我一共要准备哪些试剂，怕到时东西不全，实验时间会影响，谢谢哪位高手指导！

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第一步：PCR扩增，需要Taq酶、缓冲液和Mg离子（Taq酶会送），dNTP，ddH2O，引物1对（需设计，找公司合成）
第二步：check PCR产物，琼脂糖电泳或PAGE电泳，前者简单，建议使用，需要琼脂糖；需EB或类似的荧光染料
第三步：内切酶及缓冲液（设计好酶切位点）
第四步：读结果，需电泳，与第二步类似

可能要的仪器：PCR仪、凝胶成像系统、电泳漕及电源

另外，不是每一个位点都可以用酶切做的，不建议设计错配引物，不好做，酶太贵也不合算
作者: zzzz    时间: 2014-7-29 17:48

我想通过测序找基因组DNA中的杂合位点，请问我应该向测序公司要哪些资料，1，序列 2，图谱 还有其它的吗？我看你提到测序的原始文件，具体是什么啊？

还有一个问题，做测序找SNP，我是要依次设计引物然后PCR，连到T载体送测序公司测序吗？还是直接给他们序列让他们测？谢谢！
作者: wood533    时间: 2014-7-29 17:49

序列没有实际用处
必须要原始文件，就是测序.abi文件
然后用软件做拼接处理，再找snp
直接pcr，纯化后测序就可以了，不需要做克隆
作者: redbutterfly    时间: 2014-7-29 17:49

我的基因有20个外显子，最小的15bp，最大的190bp。我现在做突变筛查，请问在设计引物的时候，pcr产物一般要多大，才能确保测序过程中能把这些外显子序列测得准？谢谢！
作者: plaa    时间: 2014-7-29 17:50

如果你的外显子都分布很开，那么就要
一个pcr一个外显子，pcr设计最好在500-700bp
把外显子放在中间，这样测序结果最好
如果基因本身就不大，建议直接做long pcr，然后
设计测序引物分段测序就好了
作者: mimili_901    时间: 2014-7-29 17:50



QUOTE:
原帖由 plaa 于 2014-7-29 17:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
如果你的外显子都分布很开，那么就要
一个pcr一个外显子，pcr设计最好在500-700bp
把外显子放在中间，这样测序结果最好
如果基因本身就不大，建议直接做long pcr，然后
设计测序引物分段测序就好了 ...


还想问多一个问题，我的基因组DNA全长约 200000 bp，long pcr能p的基因要在多大范围之内？谢谢~
作者: qhyu    时间: 2014-7-29 17:51

200k太长，一般都是3-10k以内
你还是一段段扩增吧
作者: fei1226com    时间: 2014-7-29 18:07

能否给一个你所指的ABI文件，测序公司给我发的测序结果中给出的ABI文件就是那种峰型图啊，疑惑啊
作者: uuooii    时间: 2014-7-29 18:07


谢谢 ！倒是也有类似名称的文件 ，是原始文件吗？这种文件是不 是 可以 用很多 软件 打开  ，比如  Chromatogram，我 每次就 是 用 Chromatogram打开并分析序列。你经常强调ABI原始文件， 我以为和蜂型图是一回事，请问这种文件还可以用什么软件打开啊
作者: idoww    时间: 2014-7-29 18:08

谢谢 ！倒是也有类似名称的文件 ，是原始文件吗？这种文件是不 是 可以 用很多 软件 打开  ，比如  Chromatogram，我 每次就 是 用 Chromatogram打开并分析序列。你经常强调ABI原始文件， 我以为和蜂型图是一回事，请问这种文件还可以用什么软件打开啊

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峰型图就是原始文件，只不过你没有相应软件无法看更多信息而已。
作者: birdfish    时间: 2014-7-29 18:09

测序没什么问题的，我就是想弄清楚什么是原始文件。
zxyapple兄，我怎么能弄到abi自己的软件啊，软件名称是什么啊？谢谢
作者: 小鱼鱼    时间: 2014-7-29 18:09

新人问一个初级问题，请各位大侠帮帮忙：

我提取自行筛选的具有某种功能的菌株的DNA后，进行PCR扩增测序，将序列上传Genbank后，与数据库中的序列进行比对，以达到鉴定菌株的目的。但数据库中出来的同源性最高的菌株并不是唯一的，通常有好几个，且并不是同一个属的（当然是性质相当接近的属，否则这种方法就太不靠谱了），有时虽然是同一个属，但是不同种的，在这样的情况下，我如何确定自己的的菌的鉴定结果？
作者: xue258    时间: 2014-7-29 18:09

那要看你的功能怎么定义

我还没是没明白你做了blast后
怎么鉴定，就是看和同属的菌的基因组
相似度吗
作者: sunbent    时间: 2014-7-29 18:10

对啊，理论上是我要鉴定的菌跟库里同源性最高的那个菌是同一个属种的，但我现在遇到的问题就是同源性最高的有好多菌，而且不是一样的，不知道应该算哪个呢
作者: huifeng0516    时间: 2014-7-29 18:10

谢谢！ 我已经下了一个SeqScanner。再请教，我的一个序列200bp，我测了18次，在其中一处有的地方是A，有的是G，参考序列是G，但是A的有十二个，不知道此处是否算做SNP，对了，没出现套峰，就是单纯的A或G。关键你的序列找snp前要拼接，不要自己看[/quote]，怎么拼接啊?

还有，你说测序原始文件还可以看到很多其他信息 ，请问，用SeqScanner可以看到些什么重要信息？再次谢谢！碰到专家不容易啊
作者: sunbent    时间: 2014-7-29 18:11

对啊，理论上是我要鉴定的菌跟库里同源性最高的那个菌是同一个属种的，但我现在遇到的问题就是同源性最高的有好多菌，而且不是一样的，不知道应该算哪个呢

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这个你最好根据高变区或者是snp等marker
做进化树，看看那个菌和你的距离最近
保守区估计都差不多
作者: huifeng0516    时间: 2014-7-29 18:12

你自己去abi网站去找吧，有免费的SeqScanner.exe
关键你的序列找snp前要拼接，不要自己看

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谢谢！ 我已经下了一个SeqScanner。再请教，我的一个序列200bp，我测了18次，在其中一处有的地方是A，有的是G，参考序列是G，但是A的有十二个，不知道此处是否算做SNP，对了，没出现套峰，就是单纯的A或G。
作者: huifeng0516    时间: 2014-7-29 18:12

关键你的序列找snp前要拼接，不要自己看

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怎么拼接啊?

还有，你说测序原始文件还可以看到很多其他信息 ，请问，用SeqScanner可以看到些什么重要信息？再次谢谢！
作者: abc816    时间: 2014-7-29 18:13

你是不同样本吧
你去找一个DNASTAR软件
用seqman程序做拼接，应该在那个地方看到
只有纯和一般来说不是特正常，多测点看看再说吧
作者: wu11998866    时间: 2014-7-29 18:13

想请教各位大虾一个问题，若测序图显示存在缺失如何分析得知其缺失的到底是哪一段？ 谢谢
作者: remenb    时间: 2014-7-29 18:13

若测序图显示存在缺失，应如何分析得知其缺失的到底为何片段？
作者: ha111    时间: 2014-7-29 18:14


必须有原始参考序列
我们用phred/phrap软件包做拼接
后再看，windows下的一些软件也可以
试试danstar
作者: cwcwcww    时间: 2014-7-29 18:14


我的PCR产物 197bp测序可以么？目的是验证酶切的结果。谢谢。
作者: 2541    时间: 2014-7-29 18:14

应该可以直接测序，
不过你要看到完整的片段建议转到
载体里，因为测序开头的20-50不准
作者: 白白的    时间: 2014-7-29 18:15

求助高手，在下想测一下某基因的SNP（是动物的）可是只能查到次基因的mRNA序列（全为编码序列），我是否可以根据次序列设计引物，然后提取RNA反转录后，以cDNA为模板扩增序列，测序查找SNP？我查了文章都不是这样做的，都以DNA为模板查找SNP的？
作者: DDD    时间: 2014-7-29 18:15

1、你的物种肯定没有基因组对吧
2、你要用snp做什么，因为在基因外显子中的
   snp肯定占整个基因组的很小一部分，你只找
   这部分，在密度上会有很多地方是空洞
3、你想测序检测可以，不过不知道你要做的pcr一共
   有多大，很大还不如直接测est然后再找snp
4、如果你们课题组有经费，建议看一下illumina公司的
   新一代测序仪，重测序找snp
作者: xue258    时间: 2014-7-29 18:16



QUOTE:
原帖由 DDD 于 2014-7-29 18:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1、你的物种肯定没有基因组对吧
2、你要用snp做什么，因为在基因外显子中的
   snp肯定占整个基因组的很小一部分，你只找
   这部分，在密度上会有很多地方是空洞
3、你想测序检测可以，不过不知道你要做的pcr一共
   有多大 ...

1.我是做猪的某个基因，猪的基因组序列还没有测完，好多序列都找不到的
2.测出SNP后，看看能否引起编码的蛋白质结构发生改变
3.要做一百个样吧
请高手帮忙，谢了
作者: mysmdbl    时间: 2014-7-29 18:16

如果只做某个基因，你的方法完全可行
只不过注意有些est结果并不准确，还有设计引物
最好跨外显子，避免基因组上有同源性的序列扩增
作者: kswl870    时间: 2014-7-29 18:16

问个问题。
我参考的一篇文章，他是根据hapmap把一个基因分成了3个block。他只是说从每一个block里选择一个snp进行研究。没有提到tagsnp的信息。不过文章提到的是根据hapmap的release 19提供的数据。可能当时作者做的时候haploview里也还没有添加筛选tagsnp的功能。
我看园子里有人说，只要每个block里选择一个就可以，最好选杂合率高的那个。

我现在第一个block里是随便选的一个，主要是那几个tagsnp的序列比对不好做，blast效果很差。所以我另选了一个非tagsnp。

我现在的做法合适不？就是block里选个杂合率高点的。不管它是不是tagsnp.
作者: moonlight45    时间: 2014-7-29 18:17


由于人种不同
我建议你也是去hapmap上用chb
做block，然后再看看tagsnp的情况选择
不要用他的block，参考一下可以
作者: bring    时间: 2014-7-29 18:17

我没有用他的block。我是根据chb的数据做的block。
问题是，我可以不可以不选 tagsnp。而是选一个杂合率高的SNP去做。
作者: xevin    时间: 2014-7-29 18:18

可以，看看你的高频点能代表多大区域
心里有数就行
作者: mamamiya    时间: 2014-7-29 18:18

从block里选出来的SNP，我以为它代表的就是整个block。我理解错误了吗？
作者: zwsyrt    时间: 2014-7-29 18:18


不是block李的所有点都可以代表
最好的是经过计算的tagsnp
作者: 小糖块    时间: 2014-7-29 18:19


不是block李的所有点都可以代表
最好的是经过计算的tagsnp
作者: zwsyrt    时间: 2014-7-29 18:20

那我一个block里选一个tagsnp先做着行不，因为一个block里不止有一个tagsnp。那么多如果都做的话，要有十五个左右，按照我的检测方法，花费太大。
我可以给你传篇文献不，因为那个文献里就 是只一个block里选一个SNP，并且没说明所选的SNP是tagsnp。
作者: TNT    时间: 2014-7-29 18:20

挑选snp是一个很困难得问题
最重要的就是怕你选不能代表整个基因而有遗漏
这样你做的关联分析如果没结果就一点办法都没有
作者: okhaha    时间: 2014-7-29 18:21

而且那个文章里有两个block的D'=0.90,所以作者就在这两个block里只选了一个SNP来研究。这个文章是发表在human reproduction 上的。
我现在有两个block的D'=1.0，那我是不是可以也只在两个block里选一个tagsnp来研究。
作者: guagua    时间: 2014-7-29 18:21


你那个区域多大
用的是什么数据hapmap的
其实0.9和1.0在确定的block中差别不大
作者: yapuyapu    时间: 2014-7-29 18:22

你说你的是用的自己的数据还是hapmap的chb？
作者: moonlight45    时间: 2014-7-29 18:22

我的block用的是hapmap的chb
作者用的是hapmap的欧洲的。
作者: langlang    时间: 2014-7-29 21:45


那我建议你还多挑
几个，明显感觉chb的block
要比欧洲的复杂
作者: kewanqi2011    时间: 2014-7-29 21:45

那我block3还要不要挑，他和block2的D'=1.
block3里的037是软件自己挑选的tagsnp。
我的计划是一个block里先挑一个tagsnp去做。haploview自己在五个block里选了20多个tagsnp。因为实验预算的问题，我不能全部都去做。
作者: qqshepherd    时间: 2014-7-29 21:46


甲基化问题比较复杂
基因组修饰、引物设计、克隆转化都会有差别
我们一般用real-time pcr先筛一下在做
作者: ha111    时间: 2014-7-29 21:47


大家好，我也有一个问题，我的目的片段连接到载体上以后拿去测序，测序结果是：我的目的基因在这个载体上，但目的基因前面不是P7.5启动子的序列，多了些未知的序列，这是为什么呢？是不是我对目的片段进行末端平滑化的原因呢？会对以后的同源重组有很大的影响么？
作者: tie8    时间: 2014-7-29 21:47

你去载体了吗
应该是载体序列
作者: HPLC使者    时间: 2014-7-29 21:48

各位前辈好！我准备做BRCA基因突变的研究，由于两个基因都很大，外显子有40多个，因此直接测序的成本很高，所以想先进行一下筛选再测序。不知哪种方法比较好？原先考虑DHPLC应当不错，但是好像也要20元/片段，这样也太贵了。请问是不是RT-PCR也可以？价钱也比较便宜么？

小女子实在菜鸟，多谢各位帮忙了！
作者: mybioon    时间: 2014-7-29 21:48


rt-pcr也很贵
以前BRCA1 BRCA2我都测过
中国人里面突变率不高不到5%
如果你要清楚的了解，除了测序没什么好办法
还有就是高频点很少，所以你筛选也很困难

至于技术上 现有的筛选还是DHPLC最好
作者: vcve    时间: 2014-7-29 21:49

要找的snp都可以使用正常组织和血液
没有什么区别的

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那意思是肿瘤病人的石蜡包块里面提取的DNA是不行的了？？
我是想研究某个基因的SNP与该肿瘤的易感性及预后
作者: summerxx    时间: 2014-7-29 21:49


石蜡里的正常组织dna是降解的
肿瘤组织肯定和正常不一样
如果结果有阳性，有人提出异议
是很难解释的
作者: ha111    时间: 2014-7-29 21:50

我大概是想做300例患者，300例对照，2个基因上的5个位点。

请问现在我这样的标本数是不是偏少了？我查了国外文献很多做到了患者和对照各5000，国内很多也是1000-1500

我这样的实验，用什么方法检测比较好呢？我是临床的，实验方面很弱，以前做过realtime pcr和抽RNA和扩增质粒，其他就不知道做了。

像我这种情况，如果是自己动手做，选用什么方法比较好呢？花费大概多少？

如果给公司做，一般用什么方法呢？价格呢？
作者: ha111    时间: 2014-7-29 21:50

另外

我看了论坛以前的帖子，意思是化疗不影响SNPs，

所以受过治疗后的肿瘤病人可以抽血检查SNPs，

但是很多文献都是选用的病理诊断明确后，还没有开始化疗的病人的血液标本。。

请问我能否用大部分已经接受过治疗的患者和少数初治患者的标本一起分析SNP，然后做肿瘤易感的分析呢？
作者: bring    时间: 2014-7-29 21:51

rt-pcr也很贵
以前BRCA1 BRCA2我都测过
中国人里面突变率不高不到5%
如果你要清楚的了解，除了测序没什么好办法
还有就是高频点很少，所以你筛选也很困难

至于技术上 现有的筛选还是DHPLC最好

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多谢!那么如果制作BRCA的芯片有谁了解么？可行么?
作者: bring    时间: 2014-7-29 21:52



QUOTE:
原帖由 ha111 于 2014-7-29 21:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我大概是想做300例患者，300例对照，2个基因上的5个位点。

请问现在我这样的标本数是不是偏少了？我查了国外文献很多做到了患者和对照各5000，国内很多也是1000-1500

我这样的实验，用什么方法检测比较好呢？我是临床的，实验方 ...


现在有很多种方法可以做snp
比较便宜的是用酶切，但是要位点合适能够刚好设计成为酶切位点检测，另外就是酶也不要太贵，这样的话用该方法很有优势
也可以用realtimePCR,但是探针设计合成比较贵 而且周期长
再者就是用测序、质谱仪做了
测序又有不同的方法
呵呵 说的有点笼统
作者: bring    时间: 2014-7-29 21:52

我大概是想做300例患者，300例对照，2个基因上的5个位点。
请问现在我这样的标本数是不是偏少了？我查了国外文献很多做到了患者和对照各5000，国内很多也是1000-1500

我这样的实验，用什么方法检测比较好呢？我是临床的，实验方面很弱，以前做过realtime pcr和抽RNA和扩增质粒，其他就不知道做了。

像我这种情况，如果是自己动手做，选用什么方法比较好呢？花费大概多少？
如果给公司做，一般用什么方法呢？价格呢？

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要看什么疾病，你们的分组是不是科学
小样本的我们也得到过好的结果
作者: XYZQ    时间: 2014-7-29 21:56


方法很多，只要准确就可以
我们一般用测序
作者: ilovegaga    时间: 2014-7-29 21:57

多谢!那么如果制作BRCA的芯片有谁了解么？可行么?

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如果只做已知的可以
用tagsnp方法，做病理对照关联
不过这个基因我们认为频率较低
病例组要比较大，可以用illumina的定制芯片
不过费用还是蛮高的
作者: ilovegaga    时间: 2014-7-29 21:58

另外
我看了论坛以前的帖子，意思是化疗不影响SNPs，
所以受过治疗后的肿瘤病人可以抽血检查SNPs，
但是很多文献都是选用的病理诊断明确后，还没有开始化疗的病人的血液标本。。

请问我能否用大部分已经接受过治疗的患者和少数初治患者的标本一起分析SNP，然后做肿瘤易感的分析呢？

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用血液没问题
作者: october7    时间: 2014-7-29 21:58


那如果接受化疗的患者，有没有可能因为化疗药物的影响而出现位点的突变？

如果有，那不是化疗引起的突变和患病人群原本的SNPa混淆了？

文献都说病例组的是还没有接受化疗和放疗的病人啊
作者: ha111    时间: 2014-7-29 21:58

有可能，但全身绝大部份细胞
基因组不会改变的
作者: 911    时间: 2014-7-29 22:00

你好，请教一个问题：我要做一个基因的一个SNP,这个SNP在多篇文献上报道过的，但是发现在NCBI上没有该SNP，怎么回事？
作者: changlhsyo    时间: 2014-7-29 22:00


很正常，不同的数据库收录方式不同
作者: ukonptp    时间: 2014-7-29 22:01


我从细菌中克隆基因，在拼接后寻找ORF时，发现有一个碱基多了致使得不到一个完整的ORF，换引物重新P，得到的结果仍相同。请问：什么样的高级结构会使测序多读一个碱基呢？峰图上看很正常。纠结啊
作者: sunbent    时间: 2014-7-29 22:02

我从细菌中克隆基因，在拼接后寻找ORF时，发现有一个碱基多了致使得不到一个完整的ORF，换引物重新P，得到的结果仍相同。请问：什么样的高级结构会使测序多读一个碱基呢？峰图上看很正常。纠结啊

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建议先直接设计引物用基因组pcr一下
1、可能是克隆的问题
2、有些taq是要加上一个a的
作者: bangqi_k    时间: 2014-7-29 22:03

斑竹，问个弱智点的问题。
我对PCR片段进行反向测序，得到的结果，位点为T，那我做统计的时候，应该用A还是用T？
作者: 兔纸    时间: 2014-7-29 22:04

我的测序结果总是在170bp左右出现多个套峰，可能是什么原因？我测序的时候要求纯化，如果有杂带要求测序公司切胶纯化了，如何能够解决这个问题？A173.abi在173bp出现。
作者: tianmei001    时间: 2014-7-29 22:04

我是通过测序检测突变位点的，请再帮我分析B171.abi，最近看了不少测序方面的帖子和常见的问题，克隆测序能够解决这个问题吗？克隆载体需要多长时间？看到有的帖子提到酶切位点，克隆都必须引物酶切位点吗？没有做过克隆，是否通过酶切位点来确定自己克隆的序列起始点？
作者: seagate    时间: 2014-7-29 22:07

斑竹，问个弱智点的问题。
我对PCR片段进行反向测序，得到的结果，位点为T，那我做统计的时候，应该用A还是用T？

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a和t都可以
一般以5-3‘顺序标识
作者: sunbent    时间: 2014-7-29 22:07

我仔细看了一下你的峰图
1、不知道你的基因是否有假基因或者这段同源性如何
2、不知道你们pcr的结果，特异性如何

简单的看可能有插入确实，但很难拆开
还有可能就是有假基因
可以直接用pcr产物克隆，然后多条几个克隆测序
把2种单克隆都测到然后看看，不需要酶切位点
作者: dmg    时间: 2014-7-29 22:08

我在做一个1000bp 基因
PCR 显示片段大小一致，连T载 酶切鉴定后，构建重组表达质粒
但是送去测序结果  同源性只有30%
不知道是什么原因，或是哪一步出了问题。引物设计让师兄看过，说应该没有问题
请高手帮忙分析一下
作者: dreaming    时间: 2014-7-29 22:08

测序长度多少
是否去掉载体了，
你可以做一下blast，看看其他的都是什么
再分析，这么看来污染的可能最大测序长度多少
是否去掉载体了，
你可以做一下blast，看看其他的都是什么
再分析，这么看来污染的可能最大
作者: standbyme    时间: 2014-7-29 22:09

您好，请教您一个问题
    我的实验思路是：提取人DNA后扩增一段1.4kb编码区上游序列，并测序检测SNP多态性，分析其与疾病的关系。
    PCR遇到的问题：我在预实验时做出来的目的条带电泳后非常清晰明亮，共做出来5次，此后我就再也做不出来了，调整了体系、循环条件，换了PCR仪、引物（只是重新合成，没有再设计）、试剂，重新提DNA等办法都试了。再也不出来了。后来我到另外一个实验室做，又出来了，但电泳条带比较弱，送去测序说是信号衰减。
    我现在挺着急的，实在想不出办法了，同学的论文都快发表了，我实验还没做完！请老师一定帮忙！谢谢了。
作者: sunbent    时间: 2014-7-29 22:09



QUOTE:
原帖由 standbyme 于 2014-7-29 22:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
您好，请教您一个问题
    我的实验思路是：提取人DNA后扩增一段1.4kb编码区上游序列，并测序检测SNP多态性，分析其与疾病的关系。
    PCR遇到的问题：我在预实验时做出来的目的条带电泳后非常清晰明亮，共做出来5次，此后我就再 ...

这个我很难帮助你
我认为是实验不过熟练的因素
结果不稳定，电泳条带很弱，可以在
纯化时多加一些，不要急慢慢来
作者: wanglaoshi    时间: 2014-7-29 22:15

我想鉴定一个SNP位点，但PCR产物测序老是套峰，我可以克隆到T载体上再测序吗？谢谢
作者: bring    时间: 2014-7-29 22:20


斑竹，想请教一个问题

我现在在帮我们科室建立测序的方法，用的的ABI的3130xl测序仪，以及BigDye V3.1的测序试剂盒，我一开始先用里面提供的对照模板PGEM-3ZF（+）和对照引物—21M13(forward)做了从标准体系到1/2,1/4,1/8,1/16,1/32几个稀释度的体系，测序PCR跑完之后，我用NaAc和EDTA对测序产物进行了纯化，之后就是上机电泳了

但是最后，我的测序结果提示，都是失败的
都是NNNNNN
每一个位点都有多个不同颜色的峰重叠

您能给我一些建议吗 ？      
我现在最想证明的就是我确实能测出序列来
哪怕是用最简单的模板
作者: jiushikeshui371    时间: 2014-7-29 22:21

你能把测序原始峰图发上来吗

感觉应该是没反应

我们最多做到1/64以下但要用
5xsequencing buffer 稀释
作者: utt0989    时间: 2014-7-29 22:21

请教一下斑竹，我的测序结果回来，结果说是：“测序结果POLY-T后双峰”
什么原因导致这种结果呢？谢谢~
作者: sunbent    时间: 2014-7-29 22:22



QUOTE:
原帖由 utt0989 于 2014-7-29 22:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教一下斑竹，我的测序结果回来，结果说是：“测序结果POLY-T后双峰”
什么原因导致这种结果呢？谢谢~

最有可能的就是那个位置缺失几个碱基
你可以反向测序或者直接看下面的小峰
才分一下，看是怎么的错位情况
作者: baidukk    时间: 2014-7-29 22:22

斑竹，想请教一个问题

你这个根本就没有发生反应
也没有看到引物峰和染料峰
应该是你引物或者染料的问题
建议你检查一下你的质粒和引物是否匹配
测序反应，纯化过程
作者: baidukk    时间: 2014-7-29 22:23

还有一个问题，可能十分菜，但是我不弄清楚心中不安
还请版主指点：

在纯化测序产物时，用EDTA/NaAc/乙醇沉淀纯化

所用的EDTA究竟是游离酸的EDTA，还是EDTA的钠盐？
这对我的纯化反应有影响吗？

非常感谢！
作者: #甜#    时间: 2014-7-29 22:23


版主，想请教一下，测序PCR做完之后，有没有什么方法能验证其是否成功?我指在上基因分析仪电泳之前？
作者: mybioon    时间: 2014-7-29 22:23


1、标准的纯化可以用的7.5M醋酸氨1:30 95%乙醇 配成溶液
加入测序产物后，终浓度乙醇到70%，然后4300转4度离心
去上清

2、没有好的办法检测，只能是测序，我们一般pcr产物过膜纯化
作者: HPLC使者    时间: 2014-7-29 22:24


楼主您好：想请教下我这个测序结果中第175号中的A突变成了G，第654号的A突变成了C，帮我看看，我查了下这个应该属于有义突变。因为我后面是做表达的，应该是有影响的是吗？还想想请教下：测序连接成功的菌液可以接着涂板吗？如果挑克隆后还会发生原来那个的突变吗？怎么样才能避免突变的发生
作者: newway    时间: 2014-7-29 22:24

你的结果都是纯和子
测序是没问题的，我建议
多做几个样本，看看正常的情况
你问的问题我已经给你回过了你看一下
作者: #甜#    时间: 2014-7-29 22:24

还想请教一个问题

我今天上测序仪电泳，但是后来提示system failed，说可能有气泡

那我放在96孔板里的样品能4°保存后，能下次再继续测吗？
作者: sunbent    时间: 2014-7-29 22:25

最有可能的就是那个位置缺失几个碱基
你可以反向测序或者直接看下面的小峰
才分一下，看是怎么的错位情况

==============================================================================================================

前天测序结果就回来了，一直没有时间分析，没有回复斑竹，不好意思。我看了测序图，反向测序也是在对应的连续A位置（即正向连续T）出现套峰。我想请问一下，会不会是因为产物含有连续的TTTTTTTTT结构（或AAAAAAA）会对测序产生影响？谢谢斑竹的建议和帮助！！！
作者: xevin    时间: 2014-7-29 22:25

想请教一个问题，望不吝赐教：
   基因测序后发现移码突变，如何正式的表示出来呢，如错义突变的T60M，是60位氨基酸残基由T变成M，比较简单，可是移码突变不知道该如何表述。
  谢谢，期待您的答案~~~
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 09:28

我今天上测序仪电泳，但是后来提示system failed，说可能有气泡

那我放在96孔板里的样品能4°保存后，能下次再继续测吗？

==========================

你已经加了甲酰胺的建议放-20

甲酰胺吸水
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 09:34

前天测序结果就回来了，一直没有时间分析，没有回复斑竹，不好意思。我看了测序图，反向测序也是在对应的连续A位置（即正向连续T）出现套峰。我想请问一下，会不会是因为产物含有连续的TTTTTTTTT结构（或AAAAAAA）会对测序产生影响？谢谢斑竹的建议和帮助！！！

==============================

应该是这样的，测序的时候或者有一条链
丢失了一个，要想完全测清楚只能做克隆
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 09:35

基因测序后发现移码突变，如何正式的表示出来呢，如错义突变的T60M，是60位氨基酸残基由T变成M，比较简单，可是移码突变不知道该如何表述。
谢谢，期待您的答案~~~

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一般都是在移码突变的第一位表示一个错义
然后再以加上插入或缺失标记就可以了
氨基酸在开始移码的位置写上fra
作者: shenkunjie    时间: 2014-7-30 09:35

我的测序结果中阳性对照能够侧到800bp之后（用的是bigdye1/2稀释）

但是样品孔却常常只能测到100多bp（从bigdye1/4—1/16稀释）

您觉得只能测到100多bp，最常见和可能的原因是什么呢？

非常感谢！


作者: sunbent    时间: 2014-7-30 09:42


你13那个峰图几乎没反应，应该还是引物配比的
的问题，你再检查一下
2那个感觉是有什么结构，反应被终止了，建议预变性
温度加大到96度4分钟
作者: ha111    时间: 2014-7-30 09:44

想请教一下，我用invitrogen的PCRII载体进行的T-A克隆

用扩增出来的阳性质粒测序  

T7，Sp6正反向我都测了

T7可以测到600bp左右

Sp6可以测到1000bp左右

但是我如何判断测出来的序列中，哪一段是属于载体的，哪一段是属于PCR产物的呢？

另外，我听说一般测序800bp以内才是有效的，我这种测出超过1000bp的是否后面的序列就无效呢？

非常感谢！静待您的指点
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 09:45



QUOTE:
原帖由 ha111 于 2014-7-30 09:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
想请教一下，我用invitrogen的PCRII载体进行的T-A克隆

用扩增出来的阳性质粒测序  

T7，Sp6正反向我都测了

T7可以测到600bp左右

Sp6可以测到1000bp左右

但是我如何判断测出来的序列中，哪一段是属于载体的，哪一段是属 ...

你这个可以用一些拼接软件如dnastar 中的seqman做一下
去载体，你可以把载体序列下载下来，软件会自动给你去掉
并用xxxxxx表示
作者: avi317    时间: 2014-7-30 09:45


版主你好：

我想问下有没有关于说明SNP稳定性的文献？
作者: bamboo16    时间: 2014-7-30 09:46

版主

想请问一下

我测序时老是容易出现气泡

是不是因为pop7胶放在常温时间长了的缘故？

有办法可以避免吗？

非常感谢！！
作者: yayya    时间: 2014-7-30 09:46



QUOTE:
原帖由 bamboo16 于 2014-7-30 09:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
版主

想请问一下

我测序时老是容易出现气泡

是不是因为pop7胶放在常温时间长了的缘故？

有办法可以避免吗？

非常感谢！！

应该是是你接头那地方没有拧紧

还有胶要放在4度，用的时候再拿出来
作者: greenbee    时间: 2014-7-30 09:47

版主老师
我最近测一批PCR产物
因为有点杂带，是要求测序公司切胶回收的
有一部分结果峰图看着很奇怪，有点乱
测序公司说测了两次都这样，测失败了，通知我重新扩增样品

是什么原因呢？
我重新扩增样品需要注意什么吗？
作者: bamboo16    时间: 2014-7-30 09:49

我最近用质粒测序，在1/8，1/16梯度上已经能够得到比较稳定的结果

然后今天采用纯化PCR产物直接测序

出来的结果发现存在如下两个问题：
1）测出来的片段不够长，100多bp，200多bp居多

2）背景噪音很大
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 09:50

我最近测一批PCR产物
因为有点杂带，是要求测序公司切胶回收的
有一部分结果峰图看着很奇怪，有点乱
测序公司说测了两次都这样，测失败了，通知我重新扩增样品

是什么原因呢？
我重新扩增样品需要注意什么吗？

峰图贴上来了，帮忙看一下
非常感谢！

===================================

我看了应该说你的样本没什么问题
肯定是测序仪、试剂、或是设置问题
峰出现重叠，一般换一个模式做原始数据处理
应该可以，我上班给你处理一下再看看
作者: BOSS2011    时间: 2014-7-30 09:51

我最近测一批PCR产物
因为有点杂带，是要求测序公司切胶回收的
有一部分结果峰图看着很奇怪，有点乱
测序公司说测了两次都这样，测失败了，通知我重新扩增样品

是什么原因呢？
我重新扩增样品需要注意什么吗？

峰图贴上来了，帮忙看一下
非常感谢！

我看了应该说你的样本没什么问题
肯定是测序仪、试剂、或是设置问题
峰出现重叠，一般换一个模式做原始数据处理
应该可以，我上班给你处理一下再看看

-----------------------------------------------------------------------------

谢谢~~！！那就是说我不用再重新扩增样本咯
这个是测序公司没测好，还是彩图没处理好的问题？
作者: jujuba    时间: 2014-7-30 09:53

是测序公司的问题
我们看到的结果是经过软件做过处理的
你或者给abi的技术支持打电话，需要用
他们的软件对原始数据重新处理
作者: u234    时间: 2014-7-30 09:54

想请问一下

我最近一次质粒测序，出来的峰图很奇怪

在195bp以前，信号峰都很好，在195bp处突然像被剪刀剪断一样，就此中断无法测下去了

想请教一下您，可能是什么原因呢？
作者: c86v    时间: 2014-7-30 09:54

质粒一般很少出现这样情况
pcr产物的话往往是由于有特殊结构
双链无法打开，测序停止了，我看一下
你比一下，看有多少是你插入的片段多少
是载体，还有你用的什么载体
作者: damingxia0904    时间: 2014-7-30 09:56

大侠您好 小弟初学 我怎么检索不到与肾病相关的 SNP 啊 请帮帮忙吧
作者: finger    时间: 2014-7-30 09:56


可以去ncbi OMIM数据库查一下
作者: XYZQ    时间: 2014-7-30 09:56

我是做SNP的，最近做了很多测序，峰图
结果不是很好，不能确定是否是多态？请高手给指点一下，不胜感激！！
作者: 阿司匹林    时间: 2014-7-30 09:58

不做拼接很难判断，肯定有测序的问题
作者: eve_49    时间: 2014-7-30 09:58

请问你多次强调SNP位点要根据block选，为什么？怎么给基因分的block？为什么不是按照基因的功能来选?请指点
作者: eve_49    时间: 2014-7-30 10:00

按照cuturl('www.hapmap.org')中汉族的作参照吧
里面有，同一个block中的snp可以代表那个区域
这样挑选可以节约，如果很有钱做全基因组就不需要了
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 10:00



QUOTE:
原帖由 eve_49 于 2014-7-30 10:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
按照cuturl('www.hapmap.org')中汉族的作参照吧
里面有，同一个block中的snp可以代表那个区域
这样挑选可以节约，如果很有钱做全基因组就不需要了

麻烦能截个图吗，怎么看block，照楼主的说法，同一个block中的snp可以代表那个区域
那就是说还是要测多个block中的SNP了，也就是说每个功能都要做一个snp，不知道我理解的对不对，刚刚着手了解的太少请指点
作者: wawa    时间: 2014-7-30 10:05

请教一下版主
我做的race扩一个未知基因，使用的TAKARA的3'试剂盒，扩了一条1700多的片段，跟我预想的大小差不多，然后我就送测序，测序结果很怪，这个片段前面的400多bp（蓝色）与我之前扩的该基因的保守区（黑色）相同，有100多不同（红色）。。而且上下游的引物都能找到是正确的。。
如下图所示。黑色表示之前用兼并引物扩的保守区（与其它植物上同源性很高），蓝色表示与保守区相同的序列，红色表示不同以及后面的序列。
为什么会出现这样的情况呢？
作者: 小糖块    时间: 2014-7-30 10:05


由于race方法采用的引物有一定的随机性
所以现在不能判断多出的100bp是非特意扩增
还是你的本来序列，建议先把它去掉，或者在做一次
检验一下
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 10:05



QUOTE:
原帖由 小糖块 于 2014-7-30 10:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

由于race方法采用的引物有一定的随机性
所以现在不能判断多出的100bp是非特意扩增
还是你的本来序列，建议先把它去掉，或者在做一次
检验一下

多出的这100与其它植物上该基因有很高的同源性。应该是正确的吧
作者: caihong    时间: 2014-7-30 10:08


版主，你好。我才学做测序，有许多问题搞不懂。先请教2个问题。
1，测序反应后，反应产物在4度下能存放多长时间？
2，反应产物在精制后能存放多久？
多谢。
作者: fei1226com    时间: 2014-7-30 10:11

最近做一个PCR产物测序，其中中间估计有40+个CAG重复，正反向都试过，一直不能测通，而另外只有20+个CAG重复的片段可以测通，请问如何解决？
作者: XYZQ    时间: 2014-7-30 10:11

楼主帮帮忙！
我做RT-PCR后，结果拿去测序。比对后，匹配的是某个基因组的基因，没有相应的mRNA匹配的结果。
我很纳闷啊，我不提的是RNA吗？怎么又会去扩增到染色体上去了!
是我的模板污染吗？还是我的引物特异性不好？
请指点一下啊！
不胜感谢！！
作者: abc816    时间: 2014-7-30 10:15


你好
我的PCR产物要测序，但不知哪家生物公司更好。老板让送宝生物，但是他们的PCR产物纯化要求太高了，需要达到100ng/μl。怎样能达到。
多谢楼主
作者: zranqi_1    时间: 2014-7-30 10:16

在ncbi中：
用rs号查到的序列为什么与该基因的全序列对不上呢？
作者: 66+77    时间: 2014-7-30 10:17

各位老师，我最近学作Kras基因突变的测试，作了几个标本，没有发现突变。但是波形非常的相似，请问，有没有标本被污染的可能？
作者: 2541    时间: 2014-7-30 10:18

多出的这100与其它植物上该基因有很高的同源性。应该是正确的吧

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这样就很难判断了
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 10:18

版主，你好。我才学做测序，有许多问题搞不懂。先请教2个问题。
1，测序反应后，反应产物在4度下能存放多长时间？
2，反应产物在精制后能存放多久？
多谢。

===================================

反应产物如果已经纯化可以方很久
没有纯化，4度也就几天要不荧光信号由衰减
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 10:19

最近做一个PCR产物测序，其中中间估计有40+个CAG重复，正反向都试过，一直不能测通，而另外只有20+个CAG重复的片段可以测通，请问如何解决？

=============================================

没有什么好方法
就是测序bigdye的问题

1、建议多加bigdye，国外有文献用全反应8ul做
2、ab公司有一种dgtp bigdye试剂盒专门做高gc的可以试一下
不过很贵
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 10:20

楼主帮帮忙！
我做RT-PCR后，结果拿去测序。比对后，匹配的是某个基因组的基因，没有相应的mRNA匹配的结果。
我很纳闷啊，我不提的是RNA吗？怎么又会去扩增到染色体上去了!
是我的模板污染吗？还是我的引物特异性不好？
请指点一下啊！
不胜感谢！！

=======================

我没有听清你的问题
你的结果比对后是什么情况？
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 10:22

你好
我的PCR产物要测序，但不知哪家生物公司更好。老板让送宝生物，但是他们的PCR产物纯化要求太高了，需要达到100ng/μl。怎样能达到。
多谢楼主

==========

英俊也可以
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 10:27

在ncbi中：
用rs号查到的序列为什么与该基因的全序列对不上呢？

=========================

你先拿网页的序列做一个blast
有时候是有错误的
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 10:27

各位老师，我最近学作Kras基因突变的测试，作了几个标本，没有发现突变。但是波形非常的相似，请问，有没有标本被污染的可能？

=============================

这个
1有些突变中国人就没有
2建议做完测序拼接后再找更好看出来
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 10:27

我没有听清你的问题
你的结果比对后是什么情况？

========================================================

我的意思是我匹配的结果是另外一个基因，是在基因组里面的，不是mRNA的。

不知道这样说对不对啊？我想我提的是mRNA，为什么有基因组DNA的扩增。
作者: guagua    时间: 2014-7-30 10:28


请教一下版主，最近我对一个基因的启动子进行PCR扩增，然后测序。病例组大概是15例，有7例发现了有一个位点的改变A-G，对照组没有出现这种情况。像这种应该进一步怎么分析？点突变还是考虑SNP？
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 10:28

我的意思是我匹配的结果是另外一个基因，是在基因组里面的，不是mRNA的。

不知道这样说对不对啊？我想我提的是mRNA，为什么有基因组DNA的扩增。

======================

是在一个染色体吗
你把你的pcr引物做一下blast
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 10:29

请教一下版主，最近我对一个基因的启动子进行PCR扩增，然后测序。病例组大概是15例，有7例发现了有一个位点的改变A-G，对照组没有出现这种情况。像这种应该进一步怎么分析？点突变还是考虑SNP？

======================================

你对照多少例
建议可以加一点病例
分析时候有些软件可以做病例和对照
有一组是0的情况，看你的数据应该是很有意义的
作者: tuuu2    时间: 2014-7-30 10:30


谢谢版主的回复。我的对照组是20例，的确是没发现有这种改变。
重新收集标本可能有点难度。因为现在我已经在轮科了。
像这种情况应该怎么去报道？是属于SNP还是mutation？
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 10:30



QUOTE:
原帖由 tuuu2 于 2014-7-30 10:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢版主的回复。我的对照组是20例，的确是没发现有这种改变。
重新收集标本可能有点难度。因为现在我已经在轮科了。
像这种情况应该怎么去报道？是属于SNP还是mutation？
...

你先做统计吧，用卡方检验
肯定不是snp了，病例和对照
频率差的太多了
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 10:31

是在一个染色体吗
你把你的pcr引物做一下blast

============================================

谢谢楼主的回复！
不是在一个染色体，我做了pcr引物的blast，不是很特异。
作者: wood533    时间: 2014-7-30 10:32

请教:每一个标本，取其的DNA的PCR产物及CDNA的PCR产物做酶切，一共做了30多个样本。酶切体系中，取PCR产物10UL，内切酶1UL。37度酶切16小时。切出来的结果：DNA-PCR产物的酶切结果，有纯合子，也有杂合子。而CDNA-PCR产物全部都是杂合子。如果同一个样本中，DNA-PCR的酶切后是杂合子，那么CDNA-PCR也有可能是杂合子，但是如果DNA-PCR产物是纯合子，那么为什么CDNA-PCR酶切后是杂合子呢？如果是一两个样本这样的话还可以接受，也许是突变，可是为什么所有的CDNA-PCR产物切出来的都是杂合子呢？如果是污染，为什么DNA-PCR产物还能切出来呢？迫切请教楼主及各位朋友~~~谢谢~~~
作者: fsdd817    时间: 2014-7-30 10:32

请教:每一个标本，取其的DNA的PCR产物及CDNA的PCR产物做酶切，一共做了30多个样本。酶切体系中，取PCR产物10UL，内切酶1UL。37度酶切16小时。切出来的结果：DNA-PCR产物的酶切结果，有纯合子，也有杂合子。而CDNA-PCR产物全部都是杂合子。如果同一个样本中，DNA-PCR的酶切后是杂合子，那么CDNA-PCR也有可能是杂合子，但是如果DNA-PCR产物是纯合子，那么为什么CDNA-PCR酶切后是杂合子呢？如果是一两个样本这样的话还可以接受，也许是突变，可是为什么所有的CDNA-PCR产物切出来的都是杂合子呢？如果是污染，为什么DNA-PCR产物还能切出来呢？迫切请教楼主及各位朋友~~~谢谢~~~

===========================================

1、首先要测序验证你的实验结果
才能分析
2、你看看这个基因转录的过程有什么不同
3、酶切会受到dna的结构影响，也许双链dna有特殊结构
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 10:35

你先做统计吧，用卡方检验
肯定不是snp了，病例和对照
频率差的太多了

==============================================================================================

做了统计，是有意义的。如果这种情况应该怎么继续往下分析？单单靠测序的结果能够说明问题吗？还需要进一步做些什么实验？
作者: summerxx    时间: 2014-7-30 10:36

基本不需要了
可以按临床病例报道的方式
直接写文章，然后写点这个突变或
基因
的功能预测就可以了
作者: summerxx    时间: 2014-7-30 10:36

你好
我做从人血中提取dna，然后50ul体系跑pcr，但是发现跑出来有问题，图一我1.2.4.6都是模板跑的pcr，4和6是空白对照，但是发现跑的不好看还有不平直不规则的带，好像也不是二聚体，我觉得我也按规程操作，所有物品上高压消毒，也不像污染，图二是今天做的，第一孔是模板，第二孔是空白对照，那个不规则条带更明显，我实在找不出来为什么了，您能帮忙分下下么
作者: ending    时间: 2014-7-30 10:37


pcr buffer的mg离子浓度过高了吧
你用的什么marker
作者: yonger    时间: 2014-7-30 10:37


用的是BM2000 DNA  Marker  范围是 100.250.500.750.1000.2000
用的材料都是北京博迈德哪里买的，模板3ul，正反引物各2.5ul，5utaq酶1ul，buffer5ul，不过这里面已经加过镁了。不需要自己在另加了，剩下的用水加到50ul。关键是我在别的实验室做出来没有问题，所有的材料和量都一样，可是到了这个实验室就变成这样，老是有不同的带，不知道是不是机子问题
作者: ffaa    时间: 2014-7-30 10:38


2000bp的可以直接测序吗。
我就设计了一对引物，还要另设计中间引物吗
要是设计的话
中间引物怎么设计呢
作者: 89tongzijun    时间: 2014-7-30 10:38

请教:做基因多态性实验，从一个血液样本中分别提DNA和RNA，然后用DNA和CDNA分别做PCR，用PCR产物酶切PCR-RFLP.酶切后电泳，但是DNAPCR产物切出来的是纯合子CC，CDNA PCR产物切出来的是CT。这说明什么呢？DNA的两条链上都是C,为什么其由RNA逆转录的CDNA的PCR产物两条链分别是C和T呢？而且多个样本的DNA酶切产物和CDNA酶切产物电泳结果都不一致，尤其是当DNA酶切产物是纯合子的时候，很多CDNA酶切产物是杂合子。是因为从DNA转录到mRNA的时候发生了突变吗？上次，您说看看这个基因转录的过程有什么不同，请问应该如何知道这个答案？酶切会受到DNA的影响，是怎么样的？还有个问题，做基因多态性一定要使用高保真酶吗？不甚感激！彷徨中~望得到大家指点。谢谢！
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 10:39

用的是BM2000 DNA  Marker  范围是 100.250.500.750.1000.2000
用的材料都是北京博迈德哪里买的，模板3ul，正反引物各2.5ul，5utaq酶1ul，buffer5ul，不过这里面已经加过镁了。不需要自己在另加了，剩下的用水加到50ul。关键是我在别的实验室做出来没有问题，所有的材料和量都一样，可是到了这个实验室就变成这样，老是有不同的带，不知道是不是机子问题

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那就是很实验室微环境有关
建议换一套试剂，因为marker没问题
肯定是pcr或pcr仪的问题
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 10:40

2000bp的可以直接测序吗。
我就设计了一对引物，还要另设计中间引物吗
要是设计的话
中间引物怎么设计呢

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最好设计中间测序引物
作者: flower-201    时间: 2014-7-30 10:41


不同样品扩增同一个基因，测序结果发现在同一位点插入了一段相同的碱基序列，请问是什么原因，是本身这些样品的突变还是有其他原因造成多谢~
作者: Ao7    时间: 2014-7-30 10:42


PCR扩增出了一段GAAGAGA片段，不是我目的基因里的碱基，请教版主是什么原因造成的？
作者: tangxin_80    时间: 2014-7-30 10:42

一般可能性不大
你测序的结果是吗
我还真想不出来原因
先检查一下测序数据吧
作者: ritou1985    时间: 2014-7-30 10:43


SNP的检测可以使用HRM的方法来检测，而串联重复多态性可以使用Melt  Curve  Typing来区分，是很容易的
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 10:43

这个
1有些突变中国人就没有
2建议做完测序拼接后再找更好看出来

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这话说了不负责任，K-RAS在胰腺癌肿的突变率很高，此外，K-RAS的检测突变在一些用药也有关，特别是对于直肠癌用药特塞娃是非常有用的，常见的检测是DXS的探针法，以及HRM法。
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 10:43

请教一下版主，最近我对一个基因的启动子进行PCR扩增，然后测序。病例组大概是15例，有7例发现了有一个位点的改变A-G，对照组没有出现这种情况。像这种应该进一步怎么分析？点突变还是考虑SNP？

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你可以做个高通量的筛查，看跟这个病例之间是否有关联性
作者: tangxin_80    时间: 2014-7-30 10:45

我想问一下：在做snp时，我用的是全血抽提DNA的，我之前是将EDTA抗凝的全血放在-20°的冰箱里了，放了近半年，会不会出问题啊？还有我想问下这个全血可不可以在4°的冰箱里放一周啊？
作者: 蒲公英    时间: 2014-7-30 10:46

最好不要再4度放这么久
-20度拿出后最好尽快提取
放半年没有反复冻融没问题
作者: glass    时间: 2014-7-30 11:06

片段里有发夹结构，不能测序，是为什么呢？
作者: qhyu    时间: 2014-7-30 11:06

也不是不能

只要因为发卡结构在变性后很快就
回复成双链结构，阻止测序反应进行
可以加一些辅助解链的试剂有些可以测过去的
作者: yonger    时间: 2014-7-30 11:07


各位老师，你们好，我想问一个问题。
我最近测序的时候，所有的C和T波形都特别高，而G和A波特别的低，呈现明显的跳跃式波形。请问这是什么原因造成的呢？问指教。
多谢
作者: yjf1026    时间: 2014-7-30 11:08

各位老师，你们好，我想问一个问题。
我最近测序的时候，所有的C和T波形都特别高，而G和A波特别的低，呈现明显的跳跃式波形。请问这是什么原因造成的呢？问指教。
多谢

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峰图发上来看看，你们换bigdye和毛细管了吗
毛细管用了多少次了
作者: bamboo16    时间: 2014-7-30 11:13

谢谢版主，我用重新跑了一遍，就变正常了。也没有换任何东西。
作者: wsll    时间: 2014-7-30 11:13

一般这样的情况换run buffer
冲洗毛细管就会好
作者: tuuu2    时间: 2014-7-30 11:13

我想PCR产物直接测序，
1、但是设计的引物，扩增出来的片段（特异性片段很亮，上方还有非特异片段）
切胶纯化，都是需要注意什么？
2、我已经切了3次了（今天这次切得胶块离完心才30ul）以纯化产物为模板再做PCR时（除有引物二聚体之外，什么都没有）是不是切胶时太少的缘故？
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 11:14



QUOTE:
原帖由 tuuu2 于 2014-7-30 11:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我想PCR产物直接测序，
1、但是设计的引物，扩增出来的片段（特异性片段很亮，上方还有非特异片段）
切胶纯化，都是需要注意什么？
2、我已经切了3次了（今天这次切得胶块离完心才30ul）以纯化产物为模板再做PCR时（除有引物二聚体之外，什 ...


pcr片段多大，不超过700可以用pcr引物测序
但有可能有杂峰，不需要做2次pcr了
作者: H2O    时间: 2014-7-30 11:15

我做了一个基因启动子的甲基化测序，4个个体（2个对照2个样品），每个个体5种组织，即20个样品中均有一处G-A突变（测序总共是测了200多个），当然比例不同，假如我推测这是一处SNP，我该怎么理解这种SNP或突变？因为很多SNP有纯合的时候，可我的似乎总是杂合的？如果一个SNP总杂合，从遗传的角度该怎么理解？不知道说清楚了没，先谢谢版主了！
对了，我的基因是印记基因，即在个体中的表达是单等位的，取决于他的亲本来源
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 11:15


你是看不同组织甲基化水平吧

1、先冲技术上讲，测序找snp必须经过拼接国际通用的是phred-phrap-polyphred
软件包，为什么说必须，主要因为测序有背景杂峰，要对信号和噪音做质量评价后
才能判断是杂合子
2、遗传的角度，我还没弄清楚你的snp是甲基化带来的还是基因组本身的，你们认为
snp的产生是进化的原因吗
作者: XYZQ    时间: 2014-7-30 11:16



QUOTE:
原帖由 sunbent 于 2014-7-30 11:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你是看不同组织甲基化水平吧

1、先冲技术上讲，测序找snp必须经过拼接国际通用的是phred-phrap-polyphred
软件包，为什么说必须，主要因为测序有背景杂峰，要对信号和噪音做质量评价后
才能判断是杂合子
2、遗传的角度，我还 ...

应该不是甲基化修饰带来的，因为甲基化修饰针对的是C，修饰后要么还是C要么变T，而现在是A-G的转换，修饰有时会导致突变，几率不是很大而且随机，像这样20多个样本在同一处都有这个相同的变化，不太可能是修饰造成的，不过发文章我还真的得排除是修饰造成的可能。

平常说的SNP是指在双亲等位基因座上均会产生的突变，比如说某处发生A-G突变产生的基因型为AA，AG/GA，GG，所以测序时会有不同的峰，有时是纯和就发现不了SNP，就是你所说的“测序找snp必须经过拼接国际通用的是phred-phrap-polyphred软件包，为什么说必须，主要因为测序有背景杂峰，要对信号和噪音做质量评价后才能判断是杂合子”  这样理解对吗？

但有没有这样的可能就是某位点突变是亲本特异性的，即只有父本来源的位点突变，而母本来源位点不发生突变，这样他的基因型只有一种，即AG，所以测序时要么是A，要么是G，不会有杂峰，有这样的情况吗？版主给分析下，谢了
作者: redbutterfly    时间: 2014-7-30 11:16


版主我的不到2000bp，切胶时注意什么呀，今天我跑了两个小时的电泳，感觉切得还不错
明天再跑个PCR看看
作者: cj_mondy    时间: 2014-7-30 11:17

有非特异性条带也可以拿去测序去吗，是不是测序公司的工作人员还给切胶纯化，那么我们自己也用不着切了呗
作者: qhyu    时间: 2014-7-30 11:18


本人初进实验室，问个很弱的问题，还请各位大人多多指教

刚看了一篇文献，是研究某基因SNP多态性的，是通过基因测序的方法来找SNP，但是作者除了测该基因的序列之外又测了一次cDNA序列，实在是百思不得其解，跟引物是内含子有关吗？

还请指点迷津……
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 11:18

没实际看出为什么一定做cdna测序
可能是为了验证全基因组的测序结果
德国人做事比较严谨
作者: 831226    时间: 2014-7-30 11:19

你是看不同组织甲基化水平吧

1、先冲技术上讲，测序找snp必须经过拼接国际通用的是phred-phrap-polyphred
软件包，为什么说必须，主要因为测序有背景杂峰，要对信号和噪音做质量评价后
才能判断是杂合子

2、遗传的角度，我还没弄清楚你的snp是甲基化带来的还是基因组本身的，你们认为
snp的产生是进化的原因吗

应该不是甲基化修饰带来的，因为甲基化修饰针对的是C，修饰后要么还是C要么变T，而现在是A-G的转换，修饰有时会导致突变，几率不是很大而且随机，像这样20多个样本在同一处都有这个相同的变化，不太可能是修饰造成的，不过发文章我还真的得排除是修饰造成的可能。

平常说的SNP是指在双亲等位基因座上均会产生的突变，比如说某处发生A-G突变产生的基因型为AA，AG/GA，GG，所以测序时会有不同的峰，有时是纯和就发现不了SNP，就是你所说的“测序找snp必须经过拼接国际通用的是phred-phrap-polyphred软件包，为什么说必须，主要因为测序有背景杂峰，要对信号和噪音做质量评价后才能判断是杂合子” 这样理解对吗？

但有没有这样的可能就是某位点突变是亲本特异性的，即只有父本来源的位点突变，而母本来源位点不发生突变，这样他的基因型只有一种，即AG，所以测序时要么是A，要么是G，不会有杂峰，有这样的情况吗？版主给分析下，谢了
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 11:21

a-g杂合在反向就是c-t，这个你确定一下
首先要确定你那个地方的测序质量是可靠的，不能依靠峰图
来判断，测序文件中有质控参数，所以要拼接来判断，拼接
第一步判断的就是峰图质量，当测序质量不好的时候，本身就会
有很多杂峰在主峰之下，就像杂合子的情况
这种情况在一些遗传疾病中我见到过，我们发现可能缺失了一条亲本
但如果有家系的话，这个位点是不符合孟德尔遗传定律的
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 11:22

a-g杂合在反向就是c-t，这个你确定一下
首先要确定你那个地方的测序质量是可靠的，不能依靠峰图
来判断，测序文件中有质控参数，所以要拼接来判断，拼接
第一步判断的就是峰图质量，当测序质量不好的时候，本身就会
有很多杂峰在主峰之下，就像杂合子的情况
这种情况在一些遗传疾病中我见到过，我们发现可能缺失了一条亲本
但如果有家系的话，这个位点是不符合孟德尔遗传定律的

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“a-g杂合在反向就是c-t”这个肯定，不知该怎么说了，看看我的测序结果吧
第一排为基因组序列，其余为甲基化测序结果。123为3个可能的甲基化位点，第二个位点的G在测序中经常又为A，版主认为它可能是修饰的结果吗？这是一个样的测序结果，还有20个样均是AG杂合

若杂合确实存在，有这种基因座永远都是杂合的遗传学现象？“这种情况在一些遗传疾病中我见到过，我们发现可能缺失了一条亲本”请版主给建议些相关资料，遗传学知识太欠缺了，现在真是头大了，晕啊，不知该怎么解释这个现象了。
作者: bring    时间: 2014-7-30 11:22

我看过了
应该可能是snp
不像是甲基化的
这个位点是新发现的还是在数据库中能查到
作者: ffaa    时间: 2014-7-30 11:22

请教版主两个测序的基础的问题，给我扫扫盲。

1. 同一批标本的测序结果中，有的标本的碱基信号峰高，挺漂亮的，可有的标本信号峰矮矮的，将结果框拉长后倒是能变高——请问这是怎么回事？也就是说，峰形的高矮和测序加样量有关系吗，还是跟测序软件处理有关系？矮的峰形图是不是不如高的峰形图结果准确可靠？

2. 我一直用nested PCR的第二轮产物送测序公司，公司负责切胶纯化后测序。比如这次，送4个标本的PCR产物测序，测序前用琼脂糖电泳，3-4μl上样量，都是很亮的条带，比较单一，但公司说我的标本中2个样本量不足，需最大上样量测序，而另外2个样本量可以。请问这又是怎么回事呢？我排除了其他可能的原因，比如送错样什么的，我怀疑是测序公司切胶纯化时DNA丢失严重了才造成样本量不足的结果，我的怀疑有道理吗？

谢谢斑竹的解答。
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 11:23



QUOTE:
原帖由 ffaa 于 2014-7-30 11:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教版主两个测序的基础的问题，给我扫扫盲。

1. 同一批标本的测序结果中，有的标本的碱基信号峰高，挺漂亮的，可有的标本信号峰矮矮的，将结果框拉长后倒是能变高——请问这是怎么回事？也就是说，峰形的高矮和测序加样量有关系 ...

我们看到的峰图都是软件后生成的，测序仪出来的只有一些数字文件
一般来说峰不能太低，但看质量一般是信噪比，也就是主峰和杂峰的
比率，只要主峰干净，低点是没关系的，至于高低是和测序的效率有关
测序可以做一定的定量，如果在引物一定的情况下，是和模板浓度成正
比。
下面这个问题要看测序公司的实力和经验了，他给纯化没问题的话，有可能
是测序时上扬量过大，你有他们的测序原始文件吗，看看就知道，还有就可能
是你说的纯化的问题，一般如果片段过小，本来就会丢失很多
作者: bongte    时间: 2014-7-30 11:24

版主，这个问题没解决呢
我想PCR产物直接测序，
1、但是设计的引物，扩增出来的片段（特异性片段很亮，上方还有非特异片段）
切胶纯化，都是需要注意什么
我的特异性片段是2000bp，非特异片段比这还大
我想把特异性片段切胶纯化出来，切胶纯化都是需要注意什么？比如胶的浓度，有人告诉我用牙签挑。希望版主多给点好的意见，谢谢
作者: ukonptp    时间: 2014-7-30 11:24


版主，我想请教一下：
我P细菌的质粒片断，PCR产物估计有5K－10K，或更长，（不知道序列）。送到公司测序，一直测不通，说太大了，建议我克隆。但这么大片断克隆也很难的，想请教版主：有没有什么办法啊，能够测通呢？谢谢！！
作者: tangxin_80    时间: 2014-7-30 11:25

版主，我想请教一下：
我P细菌的质粒片断，PCR产物估计有5K－10K，或更长，（不知道序列）。送到公司测序，一直测不通，说太大了，建议我克隆。但这么大片断克隆也很难的，想请教版主：有没有什么办法啊，能够测通呢？谢谢！！

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为什么不把质粒直接送测序公司测那？  干嘛要P出来片段再测那？ 直接测质粒不是更好吗？
作者: nn255    时间: 2014-7-30 11:25


你好，请教一下pcr产物测序信号高时怎么回事？我的模版浓度都是调好的，在30-100ng/ul之间，25ul体系加2ul。还有请问公司在纯化后，测序之前会不会常规都测一下浓度？
作者: tie8    时间: 2014-7-30 11:27

一般不会再测浓度了
你最好能把原始峰图发上来
作者: abc816    时间: 2014-7-30 12:38


谢谢版主的解答，他们又调整了，这次出来结果了，但是有个结果是如下的，说是杂合，不知是不是就是污染的意思呢？
作者: guagua    时间: 2014-7-30 12:39

感觉不像是杂合子，也不是缺失，应该
有点像样本污染，你pcr产物很特异吗
作者: bring    时间: 2014-7-30 12:39

你好版主，这是我第一次去测序，有点问题不太明白
我是拿PCR产物直接去测序的，双向测通。
1、公司先后发给我了两个序列，本来我的目的片段一共1200bp，但是这前后两个序列加起来有1800bp，我不太明白是怎么回事，忘指教
2、还有就是有个样品连接未通，这是什么意思呀
谢谢
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 12:44



QUOTE:
原帖由 bring 于 2014-7-30 12:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你好版主，这是我第一次去测序，有点问题不太明白
我是拿PCR产物直接去测序的，双向测通。
1、公司先后发给我了两个序列，本来我的目的片段一共1200bp，但是这前后两个序列加起来有1800bp，我不太明白是怎么回事，忘指教
2、还有就 ...


你找一下dnastar软件对你的序列做一个拼接就好了
双向测序的时候，如果2侧都有1800了说明中间有600多
是双向互相覆盖的
如果没有测通，就是说双向加起来也不够1200，中间有空缺
作者: kuohao17    时间: 2014-7-30 12:44

求助 各位高手
怎样进行SNP单倍体型构建？
用什么软件分析？

谢谢
作者: windy+++    时间: 2014-7-30 12:45


各位高手，请教。我最近在做一个基因的SNP与疾病的关联，目前选了一个位点，做了96个样本，初步分析有统计意义，不知是否还要多选几个位点，想发好一点的文章
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 12:45



QUOTE:
原帖由 windy+++ 于 2014-7-30 12:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

各位高手，请教。我最近在做一个基因的SNP与疾病的关联，目前选了一个位点，做了96个样本，初步分析有统计意义，不知是否还要多选几个位点，想发好一点的文章
...


什么疾病，这个是关键
去遗传板块吧
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 12:46

各位大侠：问一下 测序可以测出550-600bp 没问题吧，两端多少bp测不出啊，如果我想看的点在末端54bp，可以测出来吗，

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如果测序反应没有问题 600bp 正向测序 没有问题
如果测序反应不好 正向右移几个bp设计测序引物 即可
作者: toy    时间: 2014-7-30 12:47


各位同行：
    大家好！我现在做的是人类基因多态性，用微卫星做，不知道如何分析我的测序结果！不知道我的微卫星位点是以哪几个碱基为重复单位？还有救是测序结果准确性高海是不高？还望各位高手指点指点！谢谢！
作者: bs4665    时间: 2014-7-30 12:47

1、你知道str侧翼序列吗，还要知道是几碱基重复
重复的序列是什么，就可以自己数了
2、很单一的峰都是纯和子，杂合子是叠峰，很难数
一般str不建议测序，是要跑片段分析得程序
作者: IAM007    时间: 2014-7-30 14:11


cuturl('http://www.softgenetics.com/mutationSurveyor.html')

你找一下这个软件，看能不能发砸在一起峰分开，数清楚
如果不行，只能重做了
作者: mamamiya    时间: 2014-7-30 14:12

请版主看看我这测序结果，因为是1000多bp。所以双向测序，是不是公共重叠部分如有碱基不一样的，是不是取越前面的越好呢?
作者: fox_79    时间: 2014-7-30 14:15


比如这个测序的图，从第二条链的开始测序方向数是195bp处缺失一碱基，第三条链按其测序方向数（195bp处这个地方）应该差不多是900多bp处了，遇到这种情况时，这个195这个位置到底是什么碱基？？
作者: remonte    时间: 2014-7-30 14:15


请把原始测序峰图文件拿上来
这样我也看不出来
也许是峰间距的问题
作者: taoshengyijiu    时间: 2014-7-30 14:16


版主好，我测序结果出来后，发现了一些SNP，想和人群的SNP发生率做个比较，请问怎么查人群SNP的发生率呢？
作者: one    时间: 2014-7-30 14:16


如果是你完全测序新发现的只能测正常人群50个样本后计算
若果不是新的可以去cuturl('www.hapmap.org')上找CHB就是中国汉族的数据
作者: kuaizige    时间: 2014-7-30 14:18

那个是用荧光标记的pcr引物做pcr然后
跑测序仪的片段分析程序，直接跑，就可以
得到准确的pcr片段大小
作者: xyw5    时间: 2014-7-30 14:18

谢谢版主！您的意思就是我自己只要把PCR产物送到公司让他们帮忙得到片段长度，我的试验就算做完了！那对于荧光标记引物荧光标记的选择有没有特别的要求？本人对这些都不了解！怎么样才可以既经济又可靠呢？谢谢啦！
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 14:19

各位同行：
    大家好！我现在做的是人类基因多态性，用微卫星做，不知道如何分析我的测序结果！不知道我的微卫星位点是以哪几个碱基为重复单位？还有救是测序结果准确性高海是不高？还望各位高手指点指点！谢谢！

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从您的测序图看，您的重复单位应该是4个碱基
作者: mimili_901    时间: 2014-7-30 14:20

谢谢您的帮助！可是四个样本没有办法得到一致的结论(重复单元的碱基不一样)！！（按理论来讲正向测序得到的重复单元应该是一样！测序公司也将不一致的那个样本再次测序，得到的结论和第一次一样！可否再帮忙分析分析！我在这里先谢啦！
作者: one    时间: 2014-7-30 14:21

一个基因 分成了四个BLOCK，每个BLOCK选一个标签SNP。

每个SNP单独算，都无统计学意义。

四个SNP的结果显示确实不在同一BLOCK，不存在strong LD.

问题，我继续将这四个SNP联合做单体型分析吗？做出来有什么意义？

先谢过了。
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 14:24

谢谢版主！您的意思就是我自己只要把PCR产物送到公司让他们帮忙得到片段长度，我的试验就算做完了！那对于荧光标记引物荧光标记的选择有没有特别的要求？本人对这些都不了解！怎么样才可以既经济又可靠呢？谢谢啦！

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你pcr的引物要用荧光做标记再做pcr
然后让公司跑片段分析
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 14:24

一个基因 分成了四个BLOCK，每个BLOCK选一个标签SNP。
每个SNP单独算，都无统计学意义。
四个SNP的结果显示确实不在同一BLOCK，不存在strong LD.

问题，我继续将这四个SNP联合做单体型分析吗？做出来有什么意义？

先谢过了。

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单体型分析的前题最好是单个snp有阳性
如果没有单独的很可能是假阳性
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 14:25

你好，我的目的片段分别为129bp和170bp，我是做RFLP验证SNP位点。我直接拿pcr产物测序时说片段太小，测不出来，有什么方法可以检测出片段呢？

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你好：
RFLP验证SNP位点的方法，基于电泳的检测，DNA链二级结构容易造成人工假相，使结果出现偏差。用HRM技术做SNP的检测，既简单又方便，根据分型的结果，挑选分型样本中的一个测，即可知道群体的SNP类型。
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 14:25

小弟问一个比较菜的问题，我想做一个基因KLOTHO的SNP 但是我在PUBMED的SNP查询上，没见有结果，或者是只有动物的SNP结果，没有人的SNP结果，这是怎么回事，可我看见有的论文做过关于这个基因的SNP啊，这是怎么回事，是不是我就不能做这个基因的SNP了？

还有，我查询另一个基因的SNP人类的有72个结果，我应该确定几个作为我的备选呢，如何确定呢？

谢谢……

=============================================================================================

你好：
KLOTHO 基因的SNP检测的意义不大，相关的报道就不多;另外一个看一下文献的报道，热点的SNP可以建议做一下。
同时也建议你用HRM技术做SNP,简单、快捷、方便、低成本，如果想要关于HRM技术文献需要的话，可以发邮件到我的邮箱。
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 14:25

什么疾病，这个是关键
去遗传板块吧

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你好：
可以尝试多找一些相关的文献。另外，现在用HRM技术做SNP的检测很火热，成本低、简单、快捷，利用HRM技术的实验国外已发表很多高分文章，如果需要相关的文献，可以发邮件到我的邮箱。
谢谢！
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 14:26

请教一下，我现在在做宫颈癌相关基因的SNP，标本是用的是宫颈癌组织，但大部分文献上用的标本是人外周血，想问下，现在SNP使用外周血是基于什么原则，我现在所用标本会不会影响实验结果，对实验合理性有什么影响？谢谢，

==========================================================================================================

你好：
SNP是遗传性的，不管是血液或是组织，同样能获得很好的检测的结果，血液检测因为是比较的方面，容易收集到大量的样本.
另外，建议你可以尝试用新技术HEM来做SNP的筛查，国内外相关用HRM技术做的SNP的检测已发表过多篇文献
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 14:27

有一定的意义，关键看你怎么看待这个基因
现在冲遗传的角度，可以考虑这个基因的突变对于
肿瘤发生的影响，也可以考虑作为生物学标志物评价
肿瘤的预后，至于基因本身的功能作用，单纯用snp来做
就有点困难了，应该联合基因的表达调控

====================================

可尝试用HRM技术做SNP，低成本、方便、快捷
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 14:27

求助高手，在下想测一下某基因的SNP（是动物的）可是只能查到次基因的mRNA序列（全为编码序列），我是否可以根据次序列设计引物，然后提取RNA反转录后，以cDNA为模板扩增序列，测序查找SNP？我查了文章都不是这样做的，都以DNA为模板查找SNP的？

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如果你的CDNA反转录的效率高、质量好的话，也是可以做SNP检测。
建议你用HRM技术做SNP检测
作者: DONT    时间: 2014-7-30 14:28

楼主啊，有几个词写论文的时候 不知道怎么翻译过来，也没查到相关的文献，帮个忙吧。
Allele frequency difference test
Heterozygous test
Homozygous test
Allele positivity test
Armitage’s trend test

多谢了。
作者: greenbee    时间: 2014-7-30 14:30


谢谢版主的解答，我试了试，在cuturl('www.hapmap.org')上查不到我要查询的SNP位点的发生率，请问还有没有其他的数据库可供使用？能不能简单教授一下？
作者: yes4    时间: 2014-7-30 14:31

SNP基因分型方法：sequenom、SNPlex、Taqman、RFLP、VNTR，它们的优缺点是什么啊，做大样本、多位点选哪个比较好？
作者: 04906    时间: 2014-7-30 14:31

检测SNP的方法有很多种。成本较低、通量较大的方法大都局限于已知、特定位点，如Taqman探针法。既要对已知位点分析又要查找未知位点，一般采用PCR+测序的方法，成本高、操作繁复较低。
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 14:33

那个是用荧光标记的pcr引物做pcr然后
跑测序仪的片段分析程序，直接跑，就可以
得到准确的pcr片段大小

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楼主：您好！已经按您的方法做完了我的实验，现在把我的结果传上，还望帮忙分析，分析。我仔细看了我的图，不知道那图形是不是说明荧光标记信号过强？！这样的结果是不是不准确呢？先谢谢啦！
再上传些样本扫描结果！
作者: 66+77    时间: 2014-7-30 14:33

绝大多数都没问题

基本上就是蓝色的是主峰
但是有个别峰太高，可能有误差
作者: 紫烟    时间: 2014-7-30 14:33



QUOTE:
原帖由 66+77 于 2014-7-30 14:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
绝大多数都没问题

基本上就是蓝色的是主峰
但是有个别峰太高，可能有误差

除了重做之外有没有其他的办法让数据准确呢？我做的是微卫星基因多态性，现在片段的频数已经出来了，我想问下遗传学的H-W平衡检验怎么计算呢？病例组和对照组的基因频数有没有统计学差异如何统计？因为有很多频数实际频数很小,如何对这类数据进行处理呢?还望版主多多指教！小女子在这里先谢谢啦！
作者: fox_79    时间: 2014-7-30 14:34

这个可以分开用不同组计算每个基因型
h-w平衡，一般只看对照组平衡就可以

统计计算对于这种多基因型的不知道你用过
Arlequin吗，这个软件比较适合
软件是免费的，下载网址cuturl('http://lgb.unige.ch/arlequin/software/')，分三个版本：for Windows、for Mac OS (PPC)、for Linux (x86)，我想大部分人都使用for Windows版本。这个版本包括三个部分，分别是arlequin program (bin)、Java runtime (jre)和Arlequin 2001 update (patch)，最好同时下载Arlequin Documentation中的5个文件和Arlequin User Manual（使用手册）。注意：在下载之前要Registration的！
作者: 喵咪    时间: 2014-7-30 14:34

请教：我是一名临床医生，对我管的一个病人很有兴趣，因此想进一步做实验证实，但我分生这方面的知识太缺乏了，因此请教各位大侠！
我核酸测序结果有三个位点突变，与文献报道均不一致，但做了几次都是这样，且我用的是高保真酶，现在我想看看他们表达的氨基酸是否有问题，但不知道怎样根据核酸序列翻译成氨基酸，我现在怎么做？有什么软件可用吗？万分感谢！！！
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 14:35

这个可以分开用不同组计算每个基因型
h-w平衡，一般只看对照组平衡就可以
统计计算对于这种多基因型的不知道你用过
Arlequin吗，这个软件比较适合
软件是免费的，下载网址cuturl('http://lgb.unige.ch/arlequin/software/')，分三个版本：for Windows、for Mac OS (PPC)、for Linux (x86)，我想大部分人都使用for Windows版本。这个版本包括三个部分，分别是arlequin program (bin)、Java runtime (jre)和Arlequin 2001 update (patch)，最好同时下载Arlequin Documentation中的5个文件和Arlequin User Manual（使用手册）。注意：在下载之前要Registration的！

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我做的是病例对照研究，我用的是微卫星，做人类基因多态性，想知道对照组H-W平衡检验自由度是如何确定的？先在这里谢谢啦！
作者: nvdabing    时间: 2014-7-30 14:36

这个可以分开用不同组计算每个基因型
h-w平衡，一般只看对照组平衡就可以

统计计算对于这种多基因型的不知道你用过
Arlequin吗，这个软件比较适合
软件是免费的，下载网址cuturl('http://lgb.unige.ch/arlequin/software/')，分三个版本：for Windows、for Mac OS (PPC)、for Linux (x86)，我想大部分人都使用for Windows版本。这个版本包括三个部分，分别是arlequin program (bin)、Java runtime (jre)和Arlequin 2001 update (patch)，最好同时下载Arlequin Documentation中的5个文件和Arlequin User Manual（使用手册）。注意：在下载之前要Registration的！

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首先谢谢您！一直以来帮助我，我学位论文做的是人类基因多态性，用微卫星做，方法上已经听取您的建议将PCR产物送到上海生工毛细管电泳出结果，现在进入数据统计分析阶段，现在我遇见的问题是H-W平衡检验自由度不知道如何确实？我在这里表达下我的感激之情。先谢谢啦！
也望其他大侠给些指导，小女子谢谢啦！
作者: dog002    时间: 2014-7-30 14:36

楼主:
我有一段DNA 是高GC的, 我们自己测序, 总也有杂锋, 不知道怎么能得到清晰的峰图和精确的结果.
谢谢!
作者: xyw5    时间: 2014-7-30 14:37

各位大侠：问一下 测序可以测出550-600bp 没问题吧，两端多少bp测不出啊，如果我想看的点在末端54bp，可以测出来吗，

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估计比较南，PCR产物直接测序时测序端会损失50－70bp的碱基，建议延长下游引物位置
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 14:38

楼主:
我有一段DNA 是高GC的, 我们自己测序, 总也有杂锋, 不知道怎么能得到清晰的峰图和精确的结果.
谢谢!

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最好把峰图拿上来看看
作者: wu11998866    时间: 2014-7-30 14:38

请问我想查找人类某个基因的基因序列和SNP位点，该怎么查找呢
作者: pengke1983    时间: 2014-7-30 14:38

我目前在做临床相关的遗传学课题，准备将PCR产物送到公司去测序。
我们实验室常用的是“上海生工”的测序
我想请问各位高手，“上海生工”与“华大基因”这两家公司关于测序，哪个的测序质量高一些？
多谢，我的样本量很大，8000-10000份，所以想事先问一下。多谢

怎么说呢，看你的要求和对项目的认真程度
你不督促中国公司都这么样，不要光看价格
有时候那个和质量成反比
生工分裂以后混乱过现在怎么样不好说
华大一定要盯，你这个测序量在他们也就是
小项目
作者: wsll    时间: 2014-7-30 14:39

大家好，看到这个版号高兴，相信在我即将开始的实验会有帮助！
PCR—直接测序检测SNP与疾病的相关性，将要检测的基因的SNP点大概是100个，请高手指教我该怎么确定样本量那？我做的不是家族遗传病，是普通的自身免疫性疾病
作者: damingxia0904    时间: 2014-7-30 14:39

准确计算很苦难

你看看国外阳性结果的文章

样本量多大 就差不多了
作者: kuohao17    时间: 2014-7-30 14:40

谢谢热心的版主。我这里有个问题想请教。
最近找公司做一个新基因的测序以及SNP位点的筛查。目的是想看看这个基因在正常人和病人之间的区别。基因1KB左右，公司建议最好再测上下游序列各1KB，并且样本量越多越好。我不知道是否有这个必要，因为新基因还不知道在中国人体内有没有，一切都是未知。
谢谢！
作者: zsxan1990    时间: 2014-7-30 14:40

请教版主和各位大侠
我是新手，想做先天缺陷患儿是否存在相关基因突变，我的思路是选择该基因的四个外显子，扩增出来后找基因公司测序，测序后对照公布的标准序列比较是否有突变情况。但是我没做过相关的实验室工作，不知到是否可行，在思路上能不能有更好的设计。有什么需要注意的事项吗，扩增出目的基因后的具体步骤该怎样，怎样测序，怎样对比，越详细越好，盼望赐教
作者: wawa    时间: 2014-7-30 14:41

有人用Pryosequence测序检测基因甲基化情况吗？我先做的MSP，设计引物的时候发现DNA序列没有CpG岛，但是也可以扩出目的条带。问题是如果针对这段靶序列设计Pyrosequence的话，只能检测2个CpG。是不是CpG太少没有说服力啊？那这样我的前期试验都白做了啊？求助
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 14:41

有人用Pryosequence测序检测基因甲基化情况吗？我先做的MSP，设计引物的时候发现DNA序列没有CpG岛，但是也可以扩出目的条带。问题是如果针对这段靶序列设计Pyrosequence的话，只能检测2个CpG。是不是CpG太少没有说服力啊？那这样我的前期试验都白做了啊？求助！！！

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我认为你测序验证一下就可以了
至于是不是要有说服力要看你甲基化水平
和基因的关系了
作者: IAM007    时间: 2014-7-30 14:42

我把PCR产物送去纯化，测序。发现测序结果差别很大。
最先做的都是正常人。但是有的和序列一致性有97%，有的只有75%。
而且长度也比序列少了50多个碱基（本来是1.1kb)
这样的结果怎么做SNP查找啊。发愁。
恳请帮忙看看。谢谢。
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 14:43

我把PCR产物送去纯化，测序。发现测序结果差别很大。
最先做的都是正常人。但是有的和序列一致性有97%，有的只有75%。
而且长度也比序列少了50多个碱基（本来是1.1kb)
这样的结果怎么做SNP查找啊。发愁。
恳请帮忙看看。谢谢。

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这个首先你应该应用dnastar或者其他软件把测序结果进行拼接
后对应参考序列再做snp查找
你的第一个序列是在中间有一个一条染色单体的缺失，也就是杂合性确实
第二条序列后500bp测序质量不好，应该是纯化问题
单条测序很难达到1.1kbp建议双向测序接在一起，pcr测序找snp重点是纯化
作者: zhenxin    时间: 2014-7-30 14:43

我想检测某个SNP与疾病是否存在联系。
我查了一下周围的序列，是AGGTGAAGAGGAGCCCTGAGAAGTTT
                         [C/T]
                        AGTAGAGGAGTGACATGACTTCGTT
我怎么感觉这个序列这么短啊，我要是想做PCR的话，要针对这段序列来设计引物吗？
作者: shenkunjie    时间: 2014-7-30 14:43


各位大侠：
    早上好！我刚刚涉足人类单核苷酸多态性，想请教些问题？
    如何寻找特定基因的位于启动子区域的SNP位点，并且可以采用限制性酶切的方法进行试验（在pubmed里搜索发现特定基因的SNP位点特别多，不知道哪个才是符合我要求的位点）！怎么样确定用于酶切的酶？另外SNP位点的引物必须自己设计吗？是否可以通过其他方法得到？小女子在这里谢谢啦！
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 17:03

我想检测某个SNP与疾病是否存在联系。
我查了一下周围的序列，是AGGTGAAGAGGAGCCCTGAGAAGTTT
                         [C/T]
                        AGTAGAGGAGTGACATGACTTCGTT
我怎么感觉这个序列这么短啊，我要是想做PCR的话，要针对这段序列来设计引物吗？

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你可以做一下blast然后把这个点的周围序列提出来
作者: sunbent    时间: 2014-7-30 17:03

各位大侠：
    早上好！我刚刚涉足人类单核苷酸多态性，想请教些问题？
    如何寻找特定基因的位于启动子区域的SNP位点，并且可以采用限制性酶切的方法进行试验（在pubmed里搜索发现特定基因的SNP位点特别多，不知道哪个才是符合我要求的位点）！怎么样确定用于酶切的酶？另外SNP位点的引物必须自己设计吗？是否可以通过其他方法得到？小女子在这里谢谢啦！

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一般来说启动子区长为1-3kbp
至于snp是不是可以被酶切，现在好多数据库
都没有了，有个笨的办法就是把序列拿出来
用dnastar或者neb公司网上酶切工具找到
酶切位点，在对应hapmap数据库中的snp
作者: is2011    时间: 2014-7-30 17:03


请问大虾，一个笨问题，Pfu P出来的4KB产物，如何克隆测序啊。产物序列未知，如何选载体啊？ 谢谢
作者: yueban-1147    时间: 2014-7-30 17:04

有谁知道什么是易感分数啊？求助啊！



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