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标题: 【转载】【讨论】transwell肿瘤侵袭实验的吉姆萨（Giemsa）... [打印本页]

作者: 伊莎贝拉 时间: 2014-8-1 21:17 标题: 【转载】【讨论】transwell肿瘤侵袭实验的吉姆萨（Giemsa）...

参阅论坛里关于吉姆萨染色的帖子，自撰一protocol如下，恳请园里战友指正。
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1.迁移24h-48h后，弃去滤膜上、下室的培养液（可直接倒掉，也可用移液器）；
2.在上、下室移入同样体积（上室100μl，下室600μl）的预热的PBS，轻轻吹打PBS达到清洗滤膜下表面的作用，可重复1次；
3.在下室移入4%多聚甲醛600μl，使滤膜下表面浸在其中固定细胞，15min；
4.弃去固定液，倒置transwell小室，使滤膜下表面朝上，自然风干；
5.风干后直接在倒置的transwell小室的滤膜下表面滴上数滴吉姆萨染液，10min；
6.蒸馏水清洗一遍，用棉球擦去上表面未迁移的细胞，在倒置显微镜下观察计数。
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附：本实验使用的是24孔板，以上步骤应该有不足之处，请战友批评指正，不胜感激！！

作者: dmg 时间: 2014-8-1 21:19

棉球擦去上表面未迁移的细胞应该放在最开始做，然后再用多聚甲醛固定。我用结晶紫染色，结晶紫也放在24孔板里，这样染色均匀。

作者: 伊莎贝拉 时间: 2014-8-1 21:19

QUOTE:

原帖由 dmg 于 2014-8-1 21:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
棉球擦去上表面未迁移的细胞应该放在最开始做，然后再用多聚甲醛固定。我用结晶紫染色，结晶紫也放在24孔板里，这样染色均匀。

我是看到论坛里有战友分享是染色后再擦去上表面细胞，我想是不是未固定擦去细胞会不会影响下表面细胞？期待更多意见！

作者: zbboom 时间: 2014-8-1 21:20

应该先擦去上室未侵袭或迁移的细胞，否则固定后再擦，难度增大，也有可能擦不干净，用棉签轻轻擦拭，不会影响下表面的细胞；
另外，我们将transwell的膜用刀完整的切下，放在载玻片上加上盖玻片制备成片子永久保存，也方便计数。

作者: leifengta 时间: 2014-8-1 21:20

楼主，请问你买的小室是否重复使用？如何清洗

作者: 伊莎贝拉 时间: 2014-8-1 21:21

QUOTE:

原帖由 leifengta 于 2014-8-1 21:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主，请问你买的小室是否重复使用？如何清洗

看了你的问题，我觉得你也是在做transwell实验，而且是侵袭实验，以后多多交流啊。
至于小室重复利用问题，论坛里有讨论过的，我觉得下面方法不错：用胰酶浸泡+酒精浸泡+再蒸馏水冲洗，超净台风干，使用前内室面紫外线照3小时，外室面照6小时，如果有超声冲洗可能效果更好。

作者: 伊莎贝拉 时间: 2014-8-1 21:21

补上昨天的染色结果（附图）
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个人感觉穿过去的细胞染色较浅，且轮廓不清，影响计数，估计跟Giemsa染液放置太久有关，2002年配制的，此外，染色时间有必要延长至30min，请大家批评指正：

作者: 伊莎贝拉 时间: 2014-8-1 21:23

再补上今天的实验结果吧，新配的Giemsa染液效果很好，见附图，实验目的也基本达到，很是开心。此外也补充一下这次摸索的心得吧：
1.关于Giemsa染液配制
Giemsa染色一定要新鲜配制的工作液，因为本人上午配制的工作液上午即时染色效果很好，到晚上做不同时段的染色效果明显降低。建议是Sorensen缓冲液：Giemsa原液9:1配制。
Sorensen缓冲液配制方法为1/15M Na2HPO4 + 1/15M KH2PO4，比例不同PH值不同，建议6:4或者5:5的比例，PH值大约为6.8-6.9，具体参照常用缓冲液的配制，网上一搜就有。
Giemsa原液的配制，我的经验（0.5gGiemsa粉末+22ml甘油+33ml纯甲醇）：取0.5gGiemsa粉末放在研钵里，加上甘油一起研磨，研磨一段时间后再加点甘油，直到混合液成糊状，不见颗粒，最后把总共的22ml甘油加进去搅匀，放在56℃烤箱2小时（注意：因为是烤箱，记得研钵用锡箔纸包裹以防蒸发），2小时后加入33ml纯甲醇，混匀后放在棕色瓶中4℃冰箱保存，可长期保存，网上不少资料建议保存至少一周后使用，我因为赶时间，保存3天就用了，效果如图。
2.关于固定染色步骤
温箱里取出transwell培养板后，先用预热37℃的PBS淋洗小室，别冲洗，这个时候可以先用棉签擦去上室未迁移的细胞（固定后擦除也可以，本人都试过了可行），然后在24孔板里每孔加入4%多聚甲醛约1ml，再放入小室，使小室滤膜浸泡在固定液里（这里也可以在小室内加入数滴固定液，记得避免下室有气泡存在），固定15-20min，取出小室，再次用PBS淋洗，放在桌台上风干，最后在孔板里加入新鲜配制的Giemsa工作液，每孔约800μl（以浸没小室滤膜下表面为度，小室内亦可滴入数滴染液），染色15-20min，蒸馏水冲洗，拭去小室滤膜内面多余染液，镜下观察计数。
先说这么多了，祝大家好运！！！

作者: xueyouzhang 时间: 2014-8-1 21:23

虽然我的宝贝细胞还没能成功穿越那层膜膜，但我相信总有一天它们会成功的，近期我准备再按楼主的方法试一遍。Smile

作者: DDD 时间: 2014-8-1 21:24

请问各位，关于染色的方法，能用其他染料嘛？比如伊红，苏木素，抑或是HE？

作者: 伊莎贝拉 时间: 2014-8-1 21:24

QUOTE:

原帖由 DDD 于 2014-8-1 21:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问各位，关于染色的方法，能用其他染料嘛？比如伊红，苏木素，抑或是HE？

当然行，建议多看看外文报道的染色方法，适当借鉴一下就是……

作者: ladyhuahua 时间: 2014-8-1 21:25

楼主，用棉签擦除膜上细胞这一步骤，是将膜剪下来再做的，还是直接用棉签在小室上擦除。
如果不剪下来，会不会擦除不干净？
谢谢。

作者: youreyes 时间: 2014-8-1 21:25

楼主，用棉签擦除膜上细胞这一步骤，是将膜剪下来再做的，还是直接用棉签在小室上擦除。
如果不剪下来，会不会擦除不干净？
谢谢。

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直接擦除。我的步骤是：1.取出小室；2.擦除上室细胞；3.PBS清洗；4.固定；5.染色。
剪下来擦估计会影响下室的细胞，不会擦不干净，我用的是化妆用的棉签。

作者: ladyhuahua 时间: 2014-8-2 09:29

QUOTE:

原帖由 youreyes 于 2014-8-1 21:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主，用棉签擦除膜上细胞这一步骤，是将膜剪下来再做的，还是直接用棉签在小室上擦除。
如果不剪下来，会不会擦除不干净？
谢谢。

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直接擦除。我的步 ...

我今天擦细胞时发现细胞都被擦到小室的边缘去了，结晶紫染色后形成一圈紫色的环。用力太大有担心把滤膜捅破了。
请问大家擦细胞有什么技巧啊？

作者: 紫烟 时间: 2014-8-2 09:30

紫色一圈应该不是擦过去的，是边缘无法擦去的，但这既不影响统计，又不影响拍照，可以忽略。
我用的是BD的transwell，滤膜还是比较牢靠的，反复使用几次，没有捅破的，小心一点就是。

作者: 831226 时间: 2014-8-2 09:30

我也染过transwell,感觉这个实验还是相对比较好做的~~ 附图（看到很多人给我发信问怎么染色的，这里补充说明一下，是用伊红染色的，步骤是先用多聚甲醛固定，固定之后再用伊红染色，染完色之后用棉花把上层细胞轻轻擦掉，注意不要把膜弄破，然后放点PBS去照相，注意不要让细胞干燥）

图片附件: 83825922.snap.jpg (2014-8-2 09:30, 70.68 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=26143

作者: yayya 时间: 2014-8-2 09:32

blueflyer怎么做的这么漂亮啊！我个人感觉穿过去的细胞是没有清晰轮廓的啊！请教你是怎么操作的啊，还有上层细胞是怎么搽的这么干净的呀？

作者: u76mp 时间: 2014-8-2 09:33

图片很漂亮，请问blueflyer是用结晶紫染的吗？是不是做的侵袭实验，急等赐教！

作者: 婴儿脸 时间: 2014-8-2 09:33

相关疾病：
肿瘤
楼主，我也需要做这个实验，但我养的是悬浮的细胞，请问悬浮细胞能不能做肿瘤侵袭实验？做的方法有没有什么不同？

作者: dodoit 时间: 2014-8-2 09:33

相关疾病：
浆细胞白血病
和楼上的同样的问题，白血病细胞系的悬浮细胞，能不能做侵袭实验，跪请楼主指教

作者: junhun 时间: 2014-8-2 09:36

我想请问大家在小室上层铺的都是什么包被液，Fibronection，胶原，Matrigel还是其他的东西，浓度和体积大概是多少？
还有请教一个问题，为什么小室要染色，直接计数小室下表面的细胞不可以吗？最后计数是只计数染上色的细胞，还是小室下表面所有的细胞？多谢。

作者: zwsyrt 时间: 2014-8-2 09:37

请问做这个大约需要多少钱，谢谢

作者: hold住 时间: 2014-8-2 09:37

相关疾病：
乳腺癌
blueflyer应该是HE染色吧，而且细胞有点像是乳腺癌细胞

作者: jujuba 时间: 2014-8-2 09:37

我看国内有卖Matrivgel，和BD的matrigel有区别吗（从说明上看好像挺相似），不知有有用过的战友吗？
MATRIGEL Basement Membrane Matrix
is a solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, a tumor rich in extracellular matrix proteins. Its major component is laminin, followed by collagen IV, heparan sulfate
proteoglycans, entactin and nidogen.It also contains TGF-beta, fibroblast growth factor, tissue plasminogen activator and other growth factors which occur naturally in the EHS tumor.
Matrivgel
本公司生产的Matrivgel是从小鼠肿瘤中获得的可溶性的基底膜提取物，富含细胞外
基质蛋白。其主要成份是laminin、胶原IV、 entactin、硫酸肝素糖蛋白，它还含有TGF-β
、 bFGF、组织纤溶酶原激活物（tPA）和其他一些生长因子。

作者: sunbent 时间: 2014-8-2 09:38

可以用苏木素染色或是中性红染色，背景干净，非特异吸附少

作者: sunbent 时间: 2014-8-2 09:38

应该先用多聚甲醛固定再擦掉上室中的细胞，否则下室细胞长时间离开培养基会死亡

作者: yyaxw84 时间: 2014-8-2 09:39

有没有试过用醋酸抽提，酶标仪测OD值，间接读取的？

作者: chengjie79 时间: 2014-8-2 09:39

我也染过transwell,感觉这个实验还是相对比较好做的~~ 附图

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感觉blueflyer用的是HE染色应该是迁移实验迁移实验很简单

作者: chengjie79 时间: 2014-8-2 09:44

有没有试过用醋酸抽提，酶标仪测OD值，间接读取的？

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结晶紫染色可以

作者: txwuyan 时间: 2014-8-2 09:45

楼主，请教一下你做实验时下室加多少液体呢？下室的液体是不是会通过膜很快渗透到上室中呀？我看介绍说24孔板是加500ul，可是我今天做了，发现加了500ul时整个膜浸泡在下室液体中，刚把小室放进去上室内马上就进入了下室的液体，那上室细胞不就完全浸泡在下室液体中了吗？用基培稀释还有什么意义呢？我根据自己的理解觉得下室液体应该刚好与膜相接，您觉得我的理解正确吗？

作者: txwuyan 时间: 2014-8-2 09:45

楼主，还想问下，膜重复利用时胰酶浸泡需要多久呢？酒精是75%的酒精吗，浸泡多久？蒸馏水冲洗一般几遍可以达到洗净目的？谢谢

作者: 11_hjx 时间: 2014-8-2 09:45

我用的也是HE染色，SGC 7901 效果和blueflyer的差不多

作者: zbboom 时间: 2014-8-2 09:46

我个人的经验是先在上室加完细胞后，再放入加有培养基的下室。

作者: shkudo 时间: 2014-8-2 09:47

是啊，看了大家的讨论，我也觉得奇怪，8um孔径的小室1ml或者500ul的液体，上室不渗入下室的液体才怪呢，希望有人能解答我的这个疑问，谢谢！

作者: 伊莎贝拉 时间: 2014-8-2 09:47

QUOTE:

原帖由 shkudo 于 2014-8-2 09:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

是啊，看了大家的讨论，我也觉得奇怪，8um孔径的小室1ml或者500ul的液体，上室不渗入下室的液体才怪呢，希望有人能解答我的这个疑问，谢谢！

建议你可以调一下上下室培养液的相对体积，对于24孔板，如果我记得不错的话，上室750ul，下室1ml好像就可以了，记不清了，明天去实验室查查

作者: idea2011 时间: 2014-8-2 09:48

直接用cell biolabs的transwell的盒子．transwell只是个工具．

作者: Darcy 时间: 2014-8-2 09:49

请教一下，我先后尝试了苏木精染色和吉姆萨染色，但是在显微镜下计数细胞的时候，感觉视野很暗，滤膜稍微干一点就看不清楚了，各位有没有和我一样的？

作者: sistis 时间: 2014-8-2 09:51

相关疾病：
肿瘤
你好，我最近要做肿瘤细胞的侵蚀实验，请问用什么类型的transwell小室呢？Transwell嵌套行吗？transwell小室还有铺胶吗？请指教，谢谢！

作者: bangqi_k 时间: 2014-8-2 09:52

直接计数小室下表面的细胞不可以吗？最后计数是只计数染上色的细胞，还是小室下表面所有的细胞？多谢。
同问

作者: 如影随形 时间: 2014-8-2 10:00

我想做人脐内皮细胞迁移实验，请问用什么类型的transwell小室呢，看了一下costarr ,不知道膜径，孔径多少为好，为什么。谢谢。Transwell嵌套行吗？

作者: 如影随形 时间: 2014-8-2 10:00

我想做HUVEC的transwell细胞迁移实验，请问transwell小室膜径及孔径多大为好，那里买的，，多少钱。谢谢

作者: 如影随形 时间: 2014-8-2 10:01

请问,用transwell小室检测细胞迁移性，transwell小室规格（膜直径、膜孔径、）多少为好？如costar贵吗。没做过，请高手赐教，谢谢了

作者: whitesheep 时间: 2014-8-2 10:05

我也来发下我做的图片，（×40）

图片附件: 65372105.snap.jpg (2014-8-2 10:05, 34.85 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=26144

作者: 莲花白 时间: 2014-8-2 10:06

想问下，收集跨膜细胞荧光标记进行定量可以用什么方法？
还有就是怎么收集啊？

作者: join 时间: 2014-8-2 10:12

最近做共培养，现在很是郁闷，细胞接种后根本看不到膜上的细胞，我需要观察共培养时细胞诱导分化的影响，也就是细胞的形态变化，大家有这方面实验经历的给我点建议，corning或者millipore的那一款产品比较适合啊？不甚感激！

作者: 66小飞侠 时间: 2014-8-2 10:12

我今天用1;4 稀释的Martrigel胶铺好transwell小室了，但是发现细胞不够要后天才能做，可以保存两天吗？4°还是37度？

作者: 我佛慈悲 时间: 2014-8-2 10:13

好像都没有人回答了哦，我也还是想咨询一个问题。小弟还没有开始做，想请教的问题也比较弱，还望不吝赐教。我是做肿瘤细胞的侵袭实验，1、24孔板内，上下室的培养液各加多少ul？2、24孔板的小室内一般加入多少细胞？3、准备用结晶紫染色，我看有的说不用固定，有的说要固定，有没有做过的大侠给个建议？4、结晶紫染色后醋酸脱色做间接计数的，觉得应该要计算掉落到下室内的细胞，那么醋酸脱色的具体流程有没有啊？多少33%醋酸？脱色多长时间？

作者: 131415 时间: 2014-8-2 10:13

你好，我最近要做肿瘤细胞的侵蚀实验，请问用什么类型的transwell小室呢？Transwell嵌套行吗？transwell小室还有铺胶吗？请指教，谢谢！

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我也想问这个问题，还有设计多少孔才合理，不知道怎么做统计推算？各位前辈请指教，谢谢！

作者: 131415 时间: 2014-8-2 10:13

是啊，看了大家的讨论，我也觉得奇怪，8um孔径的小室1ml或者500ul的液体，上室不渗入下室的液体才怪呢，希望有人能解答我的这个疑问，谢谢！

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corning 的transwell板的说明书上不是有上下层加培养基的量吗？你们自己都不看看么？
24孔板上层是100ul,下层是600ul

作者: 131415 时间: 2014-8-2 10:33

补上昨天的染色结果（附图）
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个人感觉穿过去的细胞染色较浅，且轮廓不清，影响计数，估计跟Giemsa染液放置太久有关，2002年配制的，此外，染色时间有必要延长至30min，请大家批评指正：
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你可以买瑞氏-吉姆萨复合染液直接染，避免了配置染液的麻烦。而且你好像没有用pbs分色，用pbs分色后可以使得核和胞质明显区分。

作者: 101010 时间: 2014-8-2 10:33

请问做这个大约需要多少钱，谢谢

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BD公司的胶5ml的大约1500，小室一板有12个的，一个板两百多。所以坐下来得两千块左右了。

作者: 101010 时间: 2014-8-2 10:37

我今天用1;4 稀释的Martrigel胶铺好transwell小室了，但是发现细胞不够要后天才能做，可以保存两天吗？4°还是37度？

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37度孵箱可以保存两个周。我用的是1：6稀释的胶铺的。

作者: ALALA 时间: 2014-8-2 10:39

应该先用多聚甲醛固定再擦掉上室中的细胞，否则下室细胞长时间离开培养基会死亡

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不错，如是操作。
还有固定液可以使一下甲醛。不用那个4%的浓度

作者: 89tongzijun 时间: 2014-8-2 10:39

请问各位，这种染色是什么染色方法啊？

图片附件: 36053528.jpg (2014-8-2 10:40, 11.71 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=26146

作者: 天蝎座 时间: 2014-8-2 10:41

我最近也在做，刚开始做，觉得挺难得，各种条件都要摸索。请问一下大家是直接把药物加到小室里面吗？

作者: 天蝎座 时间: 2014-8-2 10:42

我用的是稳定表达绿色荧光的细胞，请问一下我怎么样动态观察一下比较好？我能直接在倒置荧光显微镜下看清胶上的细胞和膜上的细胞吗？我看了感觉分不太清楚

作者: IAM007 时间: 2014-8-2 10:42

请问结晶紫染液怎么配制啊？哪位大虾告诉下，谢谢

作者: IAM007 时间: 2014-8-2 10:44

我现在正准备用coning公司的24孔板8um的transwell小室做癌细胞迁移试验，但是对transwell在这方面使用不是很了解，想请教下几个问题：
1、我看文献说，transwell上室加细胞和不含FBS培养基，下室加完全培养基，那么我想问的是，上下室一般各加多少培养基比较合适，我看的文献说得都不一样。
2、是否要保证上下室培养基液面一样高，培养基会不会互相渗透？
3、我如果想看某个浓度样品对癌细胞迁移的影响，这个浓度是根据上室培养基体积换算还是上下室培养基体积总和？
4、加上下室培养基的时候，有没有顺序要求，比如说，先加下室后加上室？

作者: ritou1985 时间: 2014-8-2 10:49

我做了很多次侵袭，但是发现细胞穿越后都是聚在一起，都不是均匀穿透的，谁能指导一下，谢谢

作者: ritou1985 时间: 2014-8-2 10:51

请问结晶紫染液怎么配制啊？哪位大虾告诉下，谢谢

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结晶紫用甲醇配成0.5%浓度，使用时用1*PBS稀释成0.1%即可

作者: 伊莎贝拉 时间: 2014-8-2 10:54

结晶紫用甲醇配成0.5%浓度，使用时用1*PBS稀释成0.1%即可

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配制结晶紫浓度文献上提的0.1%好像多一点的，有在ddH2O或PBS里配的，也有在甲醇或乙醇里配的，在后二者中，结晶紫易于溶解，甲醇和乙醇都可以固定细胞用，二者无多大的区别（如果在ddH2O或PBS中，应该先用4%PFA固定细胞）。
结晶紫是用纯的甲醇（或乙醇）配成0.5%浓度（母液），用之前以1（母液）：4.5（生理盐水）再配成染液（配好后避光可以存放24小时）。
以下是吉姆萨配方供参考：
将吉姆萨粉末1g先溶于少量甘油，在研钵内研磨30min以上，至看不见颗粒为止，再将全部(66mL)剩余甘油倒入，于56℃温箱内保温2h。然后再加入甲醇(66mL)，搅匀后保存于棕色瓶中。母液配制后放入冰箱可长期保存，一般刚配制的母液染色效果欠佳，保存时间越长越好。临用时用pH 6.8的磷酸盐缓冲液稀释10倍。

作者: redbutterfly 时间: 2014-8-2 10:55

你这个说法太搞笑了，一个小孔擦细胞会有那么难么？看上去你做transwell实验还是很少，不同细胞形态是不一样的，有些细胞转移能力强，并且呈现间质细胞形态的，穿到底层就是铺展开的。另外，transwell时间长短不一样也会略有差别。再者，一般transwell照相都是照insert中央部分，擦不干净的地方大部分只是边缘区域。

作者: yjf1026 时间: 2014-8-2 10:55

楼主你好，我想请教一下你是不是用matrigel包被小室的啊？我用的是BD的，但是稀释倍数应该是多少结果会比较好呢？有的说要1:5稀释，但是我这样尝试发现matrigel不凝固。楼主的照片效果很好呢，所以我想请教一下。

作者: junhun 时间: 2014-8-2 10:56

楼主，我想问下你PBS淋洗是用什么工具淋洗的，还有固定的话，用甲醛也是可以的吧？我是用PBS拿枪头吸取的PBS冲洗的，会把细胞冲掉么？我做的transwell中间没有细胞只有四周有，不知道是不是把细胞冲掉的缘故。还请您为我指点迷津！谢谢

作者: gemei0115 时间: 2014-8-2 10:57

BD基质胶1:7稀释较好，可以试一试

作者: 89tongzijun 时间: 2014-8-2 10:59

BD基质胶1:7稀释较好，可以试一试

作者: lixi559 时间: 2014-8-2 10:59

楼上的那张Transwell片子，个人认为不是很好，虽然细胞显示很清楚，但是不典型，很有可能是穿没穿过去的细胞都被染色了，而且细胞密度偏大。

作者: xiaoxiaoniao 时间: 2014-8-2 11:00

先固定在擦洗掉上室细胞完全可行！只是有时候小室边缘比较难擦！

作者: xiaoxiaoniao 时间: 2014-8-2 11:00

1：4稀释的时候Matrigel会不会过湿？

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