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标题: 【转帖】【求助】血管平滑肌细胞培养 [打印本页]

作者: tuomu45 时间: 2014-8-2 15:38 标题: 【转帖】【求助】血管平滑肌细胞培养

有那位作过血管平滑肌细胞培养的战友们，对于平滑肌细胞培养的体会和建议可以共享么？非常感谢!

作者: 04906 时间: 2014-8-2 15:39

我做兔胸主动脉的，比大鼠和小鼠的好做的多!但应用受限!建议你选择人的!

作者: 00无名指00 时间: 2014-8-2 15:39

我做过大鼠的,取其胸主动脉.

作者: 3N4G 时间: 2014-8-2 15:39

我做过大鼠基底动脉平滑肌细胞的培养

作者: PINK 时间: 2014-8-2 15:40

我用组织贴壁法培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,今天是第三天,我忍不住拿出来看了一下,细胞没长出来,但是有很多亮晶晶的小圆点,放大以后仔细看,发现它好象在动.它们增殖得很慢,培养液没有变黄,也没变浑浊.我做之前所有器具都经过热压灭菌的.那些小圆点是细胞吗?Question

作者: kswl870 时间: 2014-8-2 15:40

平滑肌细胞是梭形或柳叶状，不会是小圆点

作者: pencil菲 时间: 2014-8-2 15:41

我帮师姐养过原代大鼠血管平滑肌,状态好的平滑肌看不清细胞轮廓,很饱满.但是状态不好的时候,边界就清晰了,可以看到成梭状,或者说拉网状.大鼠的血管平滑肌原代好培养一些,小鼠的一直没做出来.

作者: xueyouzhang 时间: 2014-8-2 15:41

具体的方法：（我曾经在硕士时养过二百瓶左右，有问题尽管问）
原代培养：
清洁级180-220g SD大鼠，断头处死，无菌操作取一段胸主动脉，洗去血液，去除外膜纤维脂肪组织，用眼科剪纵行剪开血管，刀片刮血管内膜2~3遍，然后将血管切成约1mm2大小碎片，分装贴入培养瓶中，加入含10%小牛血清的DMEM培养基，倒置3~4小时后翻转，于37% 5%CO2的细胞培养箱中静置3天(静置期间不许震动或移动培养瓶, 以防刚贴壁的组织细胞块脱落)，然后每2天换液。一般4~7天左右平滑肌细胞从组织块中爬出，2~3周出现致密细胞层。待细胞快融合时用0.25%胰蛋白酶消化传代，取3-8代细胞做实验。
细胞传代：
将原代细胞培养瓶中的培养液吸出, 加D-Hanks液到瓶中清洗细胞表面2次。弃掉清洗液，加入0.25%胰蛋白酶1.0 ml, 将消化液均匀覆盖细胞表面，消化时间为2~4 min。这时在倒置显微镜下观察, 可见细胞成片皱缩变圆，细胞边缘折光增强。在细胞未脱落前倒去消化液，立即加入血清或含血清的培养基以终止消化。然后用滴管将细胞从培养瓶壁上轻轻反复吹打下来。然后根据细胞密度, 以1: 2~4分瓶培养。每2~3天换液, 待细胞生长到接近融合时(一般为7~10天)再传代。
注意要用Actin来鉴定一下，不然人家不信你的。

作者: zzzz 时间: 2014-8-2 15:41

我养的血管平滑肌细胞传代以后总是好几个细胞聚在一起,一团一团的,贴壁以后象一朵一朵的菊花.请教各位这是啥原因?怎样才能改善?

作者: koook5695 时间: 2014-8-2 15:46

细胞消化不充分，没有吹打成单细胞时会出现这种情况。

作者: douding66 时间: 2014-8-2 15:47

你好,我是平滑肌细胞培养的新手,我严格按照书上写的做,和你做的也差不多,细胞就是长不出来啊.和你做的不同之处就是:我用PBS液清洗外膜.我用镊子头刮的血管内膜,我的困惑就是用一次性塑料瓶就是不知道怎么铺匀,因为做了几次用滴管铺的发现把瓶底磨毛了.现在都是徒手摇匀的.但是不是很匀.
我用玻璃瓶养但听说不容易长.铺匀倒是没问题.
目前有一瓶是第6天了,细胞倒是长出来了,就是很少啊,就零星几颗,我是怕细胞长不满啊.

作者: PPT 时间: 2014-8-2 15:47

请问，酶消化法什么时候换液比较好？

作者: Ao7 时间: 2014-8-2 15:48

请问,有人做小鼠SMC吗,我做小鼠的肠系膜上动脉SMC,现在能够张出细胞,但是细胞生长很慢,2个月后才能到大瓶水平(7代左右),而且对epinephrine,angiotensin等刺激在calcium和myosin light chain phosphorylation上没有反应. a-actin染色阳性还是比较高的.
(个人感觉细胞的形态千差万别,圆形的索性的网状的,在不同的代数能见倒不同的类型,所谓波峰波谷也只有在细胞张的很满的时候,加上自己的想像才能看见T0T)
请问
1.酶消化过度是否会产生能存活但是生物学特性受损的细胞.
2.smc一般要求3-8代之内用,那大致是多少时间呢?时间太久的体外培养会导致细胞表型的改变.
3.成纤维细胞或者内皮细胞是否存在a-actin染色弱阳性?
谢谢各位

作者: sunshine039 时间: 2014-8-2 15:48

我养的血管平滑肌细胞传代以后总是好几个细胞聚在一起,一团一团的,贴壁以后象一朵一朵的菊花.我想请教一下这是啥原因?怎样才能改善?

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恭喜你，那是因为平滑肌细胞生长时具有峰谷状，说明你培养的是平滑肌细胞，而不是成纤维细胞。

作者: 天蝎座 时间: 2014-8-2 15:49

平滑肌细胞贴壁培养前三天不动它，到了第6、7天细胞才会长出来，有时候没有看到细胞并不是真的没有细胞，细胞可能在组织块下面而看不见。死细胞一般漂浮，园且折光好

作者: nut6694 时间: 2014-8-2 15:49

我做过大鼠脑血管SMC，在培养皿铺上Matrigel，细胞长得还可以，就是不知道为什么传代就不长了，请教高手指点。谢谢。

作者: 脱水萝卜 时间: 2014-8-2 15:50

因为最近看到不少战友需要培养血管平滑肌细胞，存有不少这样那样的问题，大伙把问题放在这里一起讨论吧。
年年岁岁人不同，岁岁年年细胞相似。

作者: 脱水萝卜 时间: 2014-8-2 15:51

我最近也是在用植快培养法培养细胞，但是我觉得原代操作中，剥离动脉外膜和如何纵行剪开血管，是比较复杂的操作，有哪位高手，指点迷津，谢谢了！

作者: orangecake 时间: 2014-8-2 15:51

我帮师妹剥离过动脉外膜和纵形剪开血管，我第一次做就剪的很漂亮，要用纹丝钳和眼科剪，还有前面弯头的小镊子。剥离动脉挺费时，等慢慢一丝一丝的剥，但也不难，至于剪血管就很容易了，你用钳子钳夹住一端的血管壁，眼科剪伸进血管，就像裁缝剪步那样就一溜全剪开了。我说了半天不知道你明白么，还是要自己琢磨，熟练就容易了！

作者: orangecake 时间: 2014-8-2 15:51

我们培养血管平滑肌采用的也是组织块法，尝试想用消化酶消化老养不成，但组织块法从组织块爬出细胞挺费时间，要好几个礼拜，一旦细胞传代后速度就快了，方法和上面说的差不多（北国木棉）但是我们胰酶浓度用的0.2％的，可供大家参考，还用双抗液用的浓度100U/ml。下面是一张组织块周围爬出的细胞。

作者: 箭头儿 时间: 2014-8-2 15:52

我养的血管平滑肌细胞传代以后总是好几个细胞聚在一起,一团一团的,贴壁以后象一朵一朵的菊花.我想请教一下这是啥原因?怎样才能改善?
我在培养平滑肌细胞中也遇到过这种情况，开始也不解，以为是长成了组织块，后来就知道是消化收集离心后重悬时没有完全吹打散开，所以就成了细胞团，种植贴壁后细胞就从团中爬出来，所以成了菊花样。下次吹散时吹久些，就解决了。祝你成功！

作者: avi317 时间: 2014-8-2 16:07

我的问题看来在血清问题，我用的是国产小牛血清，已经等到心理承受能力极限了。哎。。。。

作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2014-8-2 16:07

今天收到一位战友提出来的问题，非常感谢这位战友的信任，其实我也是新手。
他的问题是：
培养用的组织块你是任何处理的，是用剪刀剪碎还是用刀片切成1*1的组织块？实在铺瓶后立即加入培基，1.5小时后反转培养瓶，还是铺瓶后待组织块周围液体较少时直接翻瓶？
我个人的经验是：
培养用的组织（如胸主动脉）从体内取出来后，直接置入DMEM的血清瓶中(注意：瓶中的DMEM的量能漫过组织就可)，在血清瓶中中经过一般的清洗，把血管外表的血丝洗一洗就可，然后取出来含有D-Hanks液的平皿中，去除血管外表纤维组织，刮除内膜，稍微将平滑肌组织带有的水份用眼科镊刮除后，移入青霉素瓶中，滴入1－2滴的胎牛血清，然后用剪刀剪，一般剪100下，大概就是我们需要的组织大小了。铺瓶，加培养基，至于多少时间转正瓶子，主要还是看你铺瓶时候组织的湿度了，像我这样只在剪组织前加入1、2滴的血清的话，铺瓶时的组织一般的，所以我选择在1.5小时后翻正瓶子。
如果你铺瓶的时候发现组织还是比较湿的话，倒是有个小窍门：将瓶子横竖起来，待组织携带的水在重力的作用下集在一起，你再用吸管吸掉，这样也可以达到1.5小时后翻正瓶子的目的。
要知道，你越是晚翻正瓶子，你的细胞长出来的时间越是往后拖的哦。

作者: purrr 时间: 2014-8-2 17:01

贴壁种的组织块，三天后就有平滑肌细胞爬出，一两个组织块特多，第五天看的时候组织块周围都有很多平滑肌细胞，呈网状结构，可是在观察细胞的时候，发现组织块周围又很多（密密集集）圆形的小的细胞（不知道是不是细胞？？）这样的组织块周围就没有平滑肌细胞生长，并且据初步观察，这种东东能抑制平滑肌细胞的生长，
我的问题是，有没有培养主动脉平滑肌细胞的战友碰到过这样的情况？这种东东是什么？怎样才能除去？(以前培养的时候也有见，只是这次的平滑肌细胞比较成功，所以需小心些)

作者: purrr 时间: 2014-8-2 17:01

没有啊，没有照出来，后来被我不小心给冲掉了连并爬出来的平滑肌，（郁闷ing）我这次又种上了，如果再出现这种情况的，再上传图片，我怀疑是血细胞，真的很纳闷。

作者: wood533 时间: 2014-8-2 17:02

我做过大鼠的胸主动脉平滑肌细胞原代培养，经验如下：
1 剪的组织块要小一点，尽量要有多角形，以便细胞爬出来；
2 操作过程中要避免过分牵拉血管；
3所用的大鼠不要太大，150g左右
4把组织块贴入瓶子中时，可以沾点百分之二十的胎牛血清，那样更容易铺平
这是我的一些小经验，以供参考

作者: purrr 时间: 2014-8-2 17:02

我养的血管平滑肌细胞传代以后总是好几个细胞聚在一起,一团一团的,贴壁以后象一朵一朵的菊花.请教各位这是啥原因?怎样才能改善?

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刚巧手头上有这种菊花状的形状。大伙一起看看是不是呢？Blush

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=26160

作者: purrr 时间: 2014-8-2 17:03

再来一张20培镜的：

图片附件: 82718371.jpg (2014-8-2 17:03, 50.74 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=26161

作者: 33号 时间: 2014-8-2 17:03

有那位作过人脐动脉平滑肌细胞培养的战友们，请问原代培养后怎样才能成功传代呢!不胜感谢！

作者: 33号 时间: 2014-8-2 17:03

我这有刚拍了一张SMC原代培养后爬出来的细胞，供参考。
我正准备传代，不知该注意些什么，也有劳各位战友的宝贵建议！感谢

图片附件: 81141863.snap.jpg (2014-8-2 17:03, 32.69 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=26162

作者: 锤子 时间: 2014-8-2 17:04

用0.25%的胰酶 EDTA消化,细胞稍变圆后就可以传代了 ,原代培养成功,传代就简单了.

作者: PCR 时间: 2014-8-2 17:04

由于第一次做SMC原代培养，只有几个组织块游离出SMC来，我把组织块去掉好又培养了一周左右，但是游离出来的细胞似乎没有增殖的趋向，还是原来那么多，且仍是区域那一块，所以更谈不上传代了现在……真是非常的苦恼！不知如何是好，那位高手能否指点迷津，小弟不胜感激啊：）

作者: gogo 时间: 2014-8-2 17:04

清洁级200-250gSD大鼠，断头处死，无菌操作取一段胸主动脉，放入含双抗的DMEM的培养皿中，用直镊去除外周脂肪组织，眼科剪纵行剪开血管，弯镊刮血管内膜2~3遍，弯镊压住血管中段，另一弯镊向下刮下中膜，去除外膜组织；然后将中膜转移至另一培养皿中（预先加入1-2滴100%胎牛血清），弯剪剪成约1mm大小碎片，均匀铺在皿底，待其稍干燥后（约2-3mins），自边缘缓慢加入20%胎牛血清的DMEM培养基，注意勿使组织块飘起；轻轻转移至37% 5%CO2的细胞培养箱中静置培养，期间不要动，以免组织块飘起；约7-9天开始有细胞从组织块周围爬出，此时可更换培养液，继续培养；约14天左右细胞融合成大片，可进行传代；原代和第一代均用20%胎牛血清，以后为10%小牛血清；如果细胞长得较快，如3-5天长出，要怀疑是否有外膜成纤维细胞的污染。因此分离中膜和外膜非常重要。

作者: 101010 时间: 2014-8-2 17:05

我一直在用贴块发做，可是隔了3－5天后还是没有长出来，在镜下只能看见组织块，怎么就长不出来呢？那位高手曾经用贴块法，遇见过这种情况没有啊，谢谢指教了！跪谢！

作者: 雪花子 时间: 2014-8-2 17:05

你可以再等几天，隔两三天换一次液，我上回做得等了一周多的，还有观察的时候要调好焦，有时长出来了也没发现。祝好运。

作者: 101010 时间: 2014-8-2 17:05 标题: 回复 #37 雪花子的帖子

可是我今天已经第六天了，还是只有组织块啊，真不知道是什么原因，我极度郁闷中。

作者: applebook=213 时间: 2014-8-2 17:06

原代的平滑肌细胞可以传几代?

作者: applebook=213 时间: 2014-8-2 17:06

QUOTE:

原帖由 101010 于 2014-8-2 17:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
可是我今天已经第六天了，还是只有组织块啊，真不知道是什么原因，我极度郁闷中。

不要着急,这样的情况,就要考虑重新再培养了,注意培养细节,速度要快,注意保持血管段的湿度和营养度,慢慢做就有感觉了.

作者: KGZ564 时间: 2014-8-2 17:06

哪位战友知道怎样让SMC长的快一点呢？谢谢谢谢。

作者: 园丁## 时间: 2014-8-2 17:07

再来一张20培镜的：

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典型的细胞老化，传代不及时造成，要及时传代，估计这瓶细胞没得救了。

作者: qianqin1977 时间: 2014-8-2 17:07

大隐静脉平滑肌细胞，结晶紫染色。

图片附件: 28144183.jpg (2014-8-2 17:08, 12.89 KB) / 该附件被下载次数 132
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=26163

作者: lgm 时间: 2014-8-2 17:08

我做的兔子vsmc元代培养失败了，只好买了细胞株，现在长得超慢。大家支招啊！做试验超过8代就不好用了是吗？
我要加药测增值，第9代以后行不？
再就是谁知道高半胱氨酸的溶解方法？
求救！！！

作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2014-8-2 17:08

长得慢可能是没有加生长因子，你可以加FGF－2之类得试试，但是价格挺贵得，你可以买国内得好像便宜点。
应该说超过了8代了，细胞基本是走下坡路了，不适合做实验，你可以把刚买得细胞株扩培后再用，要么冻存起来备用。

作者: 荷塘青蛙！ 时间: 2014-8-2 17:10

各位战友，由于实验需要，本人急购几瓶人脐动脉平滑肌细胞……
或者是哪儿可以买得到呢？望指点迷津，感谢…感谢。

作者: H2O 时间: 2014-8-2 17:11

请问，酶消化法什么时候换液比较好？

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想请教你主动脉血管平滑肌细胞原代培养用的是消化法吗？
用何种消化酶？胶原酶（哪型）还是胰酶？时间、浓度如何控制?
多谢！！！

作者: bhka 时间: 2014-8-2 17:11

这肯定是VSMC,呵呵，我养过，

作者: 987789 时间: 2014-8-2 17:12

你培养的血管平滑肌好像很不错，请问你是用什么方法，详细指点一下好吗

作者: bring 时间: 2014-8-2 17:12

为什么我贴的组织块不见有细胞长出？我是将血管用眼科弯剪剪成约1mm2大小碎片，分装贴入培养瓶中，静置3~4小时后，加入含20%胎牛血清的DMEM培养基，于37% 5%CO2的细胞培养箱中静置培养。高手，请帮忙分析一下原因！

作者: feima+ 时间: 2014-8-2 17:12

楼上的细胞跟我的细胞一样，好像都看不到细胞核啊，我还以为我的细胞长的不好呢。
明天再养一批原代，纵行剖开血管那一步我总是弄不好，多努力了

作者: INK 时间: 2014-8-2 17:13

请教，谁有人血管平滑肌细胞培育的经验，烦请指教，或者哪儿有现成的血管平滑肌细胞株可以买到，帮忙指点，刚开始做实验，经验不足，有时问的问题可能比较弱，总之多多指教各位

作者: yonger 时间: 2014-8-2 17:13

你的细胞是因为用胰酶消化后吹打的不够,细胞仍然成团,而且团很大,所以培养时细胞就是团块状的.以后尽可能吹打细胞使之吹散就可以了
试试吧

作者: superboy 时间: 2014-8-2 17:13

我养的血管平滑肌细胞传代以后总是好几个细胞聚在一起,一团一团的,贴壁以后象一朵一朵的菊花.请教各位这是啥原因?怎样才能改善?

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是啊。。我目前也是这个情况。。。。。。
请问大虾们，这些菊花是不是成纤维细胞阿？？？
感觉不太像平滑肌细胞呢。。。。。。。。。。
谁来回答以下阿
谢谢。。。。。。

作者: bs4665 时间: 2014-8-2 17:15

我做过兔脑基地动脉平滑肌，，，帖块法，，48小时之内就有细胞张出来，。快的话1周就能传带了第一传的时候一传3，，3天之内就能张满5×5的瓶子。。。根本不需要铺什么胶，，我在台子外面取材，，然后放进台子里面。。。用的培养基是只加1。4克碳酸氢钠的高糖DMEM，，，碳酸氢钠切不可多加否则细胞爬不出拉。。。。。。。关于翻面，，我认为倒置两小时比较好组织块基本上完全贴了。。。有时候消化都消化不下来啊。。。。。。我发现当细胞状态好的时候不会成菊花状形态不好了就会。。。。

作者: langlang 时间: 2014-8-2 17:15

我这有刚拍了一张SMC原代培养后爬出来的细胞，供参考。
我正准备传代，不知该注意些什么，也有劳各位战友的宝贵建议！感谢

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我个人觉得上面的细胞像是成纤维细胞呢。。。

作者: mimili_901 时间: 2014-8-2 17:16

我最近也是在用植快培养法培养细胞，但是我觉得原代操作中，剥离动脉外膜和如何纵行剪开血管，是比较复杂的操作，有哪位高手，指点迷津，谢谢了！

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呵呵，我也有同样的困惑：由于刚开始做，不知道如何顺利剥离动脉外膜。我在其他大鼠手术中，在显微镜下能够很清楚的看出血管外膜，但是在超净台内却分不清楚外膜，更不能像文献中所说的“袖套样”剥离，或者纵行剖开后大块的剥离，主要就是分不清结构，不知道各位有什么好方法没？谢谢

作者: wanglaoshi 时间: 2014-8-2 17:16

我感觉翻瓶的时间尽量久点好，我一般是前一天晚上做，倒置瓶，第二天早上一大早加20％的培养基，细胞长得还是不错的，就是要注意在前一个礼拜不要动瓶子，不然不容易贴壁，细胞在5－6天时细胞就蛮多了。

作者: ending 时间: 2014-8-2 17:16

我下半年也要开始养平滑肌细胞，取的就是大鼠胸主动脉，用组织块法。
今天看到这么多高手的经验，真是受益非浅！希望以后大家多来指点。
我导师以前培养过平滑肌细胞，她说原代培养用20%牛血清（国产的）效果很好，7d就长开了。

作者: birdfish 时间: 2014-8-2 17:17

我最近用酶消化法养出了一些小鼠主动脉平滑肌细胞下面是放大200倍的照片麻烦大家给鉴定一下

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作者: DONT 时间: 2014-8-2 17:17

也做的小鼠的，贴壁法，20%进口胎牛。4d一般就有少量细胞爬出来了。
剥外膜的时候个人感觉还是管状的时候好剥，从一头找到外膜结构慢慢剥离即可，切开之后结构就很难掌握了。
倒是有一个问题请教，一般都说用3-8代，这个传代数指的就是用胰酶消化的次数吗？也就是说是从细胞融合后第一次用胰酶传代算是第二代开始吗？

作者: 2541 时间: 2014-8-2 17:18

我做的是大鼠肺动脉血管平滑肌细胞培养用贴壁法其实细胞爬出来也就一天左右如果两三天出不来一般就over了

作者: finger 时间: 2014-8-2 17:18

感觉总是外膜剥不干净,每次种到培养瓶后,第3天换液是总是发现很多散在的细胞,那简直就是疯长啊,再过三天换液时基本就快长满了,高手帮忙分析一下,这是不是就是成纤维细胞污染啊?我应该怎么办啊?不甚感激!

作者: wsll 时间: 2014-8-2 17:18

消化法培养基底动脉
镜下看到消化成细胞了
培养3天后却没看到细胞贴壁，
高手鉴定下，

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作者: wsll 时间: 2014-8-2 17:19

只看到血管块，没看到细胞，郁闷

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作者: wsll 时间: 2014-8-2 17:20

可能是什么原因呢？是因为
“平滑肌细胞贴壁培养前三天不动它，到了第6、7天细胞才会长出来，有时候没有看到细胞并不是真的没有细胞，细胞可能在组织块下面而看不见。”吗？

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作者: 969 时间: 2014-8-2 17:20

兔主动脉平滑肌细胞培养，培养基选用DMEM，还是1640好呢？我购得家兔是普通级的，可以吗？家兔得处死方式对实验有影响吗？请各位大侠不吝赐教，小娣不胜感激！

作者: woshituzhu 时间: 2014-8-2 17:21

我现在开始作这方面的实验，占个位置，下次来看

作者: uuooii 时间: 2014-8-2 17:22

请教各位高人，原代的大鼠平滑肌细胞与平滑肌细胞株在形态上如何鉴别？谢谢！

作者: minran_1980 时间: 2014-8-2 17:22

想请教各位大虾,血管内皮生长因子是否有促血管平滑肌细胞生长的作用?如有相关文章能否给我发一份?谢谢

作者: leifengta 时间: 2014-8-2 17:22

我用的是DMEM高糖，杭州四季青的血清，培养家兔血管平滑肌细胞。做完原代，第二天看一下瓶中培养液，浑浊了就没救了。

作者: flower@@ 时间: 2014-8-2 17:23

哪里有卖平滑肌细胞株的呀

作者: memory 时间: 2014-8-2 17:23

我们实验室是专门做血管平滑肌细胞的

作者: bling 时间: 2014-8-2 17:23

您好！请问您是哪里的朋友。您的细胞能卖我一点吗？我实验急需这种细胞。谢谢！

作者: 9妖9 时间: 2014-8-2 17:24

我用组织块法培养平滑肌细胞连做了三次，严格按照文献上来的，10%FBS+DMED+双抗，4小时左右翻正培养瓶，可只在组织块周围出现了丝状物，似乎还漂浮着在，没有什么细胞形态的东西长出来，不知哪里出了问题郁闷！望高手指点迷津

作者: youyou99 时间: 2014-8-2 17:26

我用的组织块法，做了4次了，但培养几天后观察，发现在组织块周围密布着絮状的丝状物，有的也是漂浮存在，没有细胞爬出啊！！每次都是这样的情况，不知道这些丝状物是什么东西，还望高手指点啊。。。
用的是冰的PBS、20%胎牛血清的DMEM 、倒置2小时左右
不知道问题出在哪啊郁闷！！

作者: any333 时间: 2014-8-2 17:26

具体的方法：（我曾经在硕士时养过二百瓶左右，有问题尽管问）
原代培养：
清洁级180-220g SD大鼠，断头处死，无菌操作取一段胸主动脉，洗去血液，去除外膜纤维脂肪组织，用眼科剪纵行剪开血管，刀片刮血管内膜2~3遍，然后将血管切成约1mm2大小碎片，分装贴入培养瓶中，加入含10%小牛血清的DMEM培养基，倒置3~4小时后翻转，于37% 5%CO2的细胞培养箱中静置3天(静置期间不许震动或移动培养瓶, 以防刚贴壁的组织细胞块脱落)，然后每2天换液。一般4~7天左右平滑肌细胞从组织块中爬出，2~3周出现致密细胞层。待细胞快融合时用0.25%胰蛋白酶消化传代，取3-8代细胞做实验。
细胞传代：
将原代细胞培养瓶中的培养液吸出, 加D-Hanks液到瓶中清洗细胞表面2次。弃掉清洗液，加入0.25%胰蛋白酶1.0 ml, 将消化液均匀覆盖细胞表面，消化时间为2~4 min。这时在倒置显微镜下观察, 可见细胞成片皱缩变圆，细胞边缘折光增强。在细胞未脱落前倒去消化液，立即加入血清或含血清的培养基以终止消化。然后用滴管将细胞从培养瓶壁上轻轻反复吹打下来。然后根据细胞密度, 以1: 2~4分瓶培养。每2~3天换液, 待细胞生长到接近融合时(一般为7~10天)再传代。
注意要用Actin来鉴定一下，不然人家不信你的。
......

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请问你的DMEM是高糖还是低糖的阿？

作者: xue258 时间: 2014-8-2 17:27

我用的是高糖的
。。。
贴壁法一直没有成功
急死了
不知道问题出在哪

作者: IAM007 时间: 2014-8-2 17:28

培养SMC一定要在培养皿上铺Matrigel吗？还是有特殊需要阿？

作者: feima+ 时间: 2014-8-2 17:29

为啥俺们的VSMC是长条分支状呢？？vasscular smooth muscle call

作者: 白白的 时间: 2014-8-2 17:29

我现在有个很急迫的问题要请教高手，我是采用的酶消化法培养的。原代长的挺好，大概5-7天就长满了可是一传代就死了。我采用了很多方法试用0.25的胰酶加0.02的EDTA，也用过不加EDTA的消化大概在两分钟左右。消化完了还很难吹打下来，时间长了也不贴壁。现在郁闷的都快不行了眼看着一瓶瓶的细胞都被传代传死了，心痛啊高手帮帮忙吧

作者: 66+77 时间: 2014-8-2 17:30

最近养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞出现点问题，我用的是10%FBS的DMEM/F12培养基，之前的细胞形态学一直很好(图1)！但从第四代开始就出现这样的情况（图2，3，4）.
有人说是发生去分化了，还有人说我消化传代是不好。不过在消化过程中也的确存在问题，每次用胰酶消化后，有的细胞很快就短缩变圆悬浮，但有的区域就是贴着不下来！用吸管吹大后细胞死了，这个原因同学帮我找了，是因为我没加培养基就吹打了，对细胞损伤比较大！

作者: 66+77 时间: 2014-8-2 17:30

之前的细胞形态学一直很好(图1)

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作者: 66+77 时间: 2014-8-2 17:31

图1，2，3均是40倍下照片，图4是100倍下
从第四代开始就出现这样的情况（图2，3，4）.

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作者: 66+77 时间: 2014-8-2 17:31

从第四代开始就出现这样的情况（图2，3，4）.

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作者: 66+77 时间: 2014-8-2 17:31

从第四代开始就出现这样的情况（图2，3，4）. 上两幅分别是图2，3.
像这幅图中所示（图4），感觉细胞成片生长，且透光度变低！

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作者: eric930 时间: 2014-8-2 17:32

我在用酶消化法做，只用了0.25%的胶原酶1，得到的细胞较少，看来方法还需要改进啊，不过得到的细胞形态和楼上的很像，细胞的边缘很模糊，这样的状态细胞一般就不长了。

作者: bohe221 时间: 2014-8-2 17:32

我养的平滑肌细胞也这样，不知你的问题现在解决了吗

作者: bohe221 时间: 2014-8-2 17:33

平滑肌细胞原代一传代就长不起来，状态越来越不好怎么回事啊，请高手指点

作者: wmp1234 时间: 2014-8-2 17:33

大鼠VSMCs用胶原酶1酶解的方法有谁用过，还希望各位战友不吝赐教啊！！

作者: utt0989 时间: 2014-8-2 17:33

我培养的是小鼠平滑肌细胞,用的是进口胎牛血清(20%),DMEM高糖,可是第五天了一个细胞也没有长出来呀!(腹主动脉组织块贴壁法)0.2%明胶包被培养板.我不知道问题出在那,请高人指点迷津.

作者: pengke1983 时间: 2014-8-2 17:34

我做肺动脉平滑肌细胞，原代长得不错，传代后细胞不贴壁，贴壁的细胞也不长，看着有点老化，大家帮忙分析下原因。DMEML 20%胎牛四季清的 0.125%胰酶消化

作者: junjie05 时间: 2014-8-2 17:36

正准备养大鼠主动脉平滑肌细胞，先来跟大师们学下一下。主要是没有具体的感觉，所以心里还是没底，还不知道能不能成功，愿天主保佑吧！

作者: junjie05 时间: 2014-8-2 17:36

我做过鼠胸主动脉的，可以发消息给我

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我是新手，想养大鼠主动脉平滑肌细胞，请问我该注意些什么呢？我现在对主动脉的内膜和外膜不太清楚，不知道这两者以什么作为明显的界限来刮掉。也不知道具体哪层才是平滑肌层。请高手指点，谢谢！

作者: u76mp 时间: 2014-8-2 17:36

我做的原代一般5天左右爬出来，开始长势挺好的，一个多星期就可以传代了，但是传代了就不长了，而且慢慢就开始一点点死了漂起来，做了几次都是这样，请高手指点，谢谢！

作者: hyuu 时间: 2014-8-2 17:37

我也做的平滑肌细胞，也是最早5天长出来，但还没有发现传代后不长，20天可以长到5代

作者: 101010 时间: 2014-8-2 17:37

弱弱的问下：倒置的目的是什么？

作者: whitesheep 时间: 2014-8-2 17:39

我也是完全按照步骤做的，可是就是很难见细胞爬出来
而且在镜下看的时候总是觉得组织块粘连到一起了
请教各位大侠，组织块要怎么贴才能贴的好呢？
是不是我剪得还不够
但是也是1mmX1mm大小的啊

作者: mercedes 时间: 2014-8-2 17:39

为什么你培养皿上要铺上Matrigel，我直接种在25MM3的培养瓶就可以贴壁生长了啊

作者: mercedes 时间: 2014-8-2 17:39

我在养大鼠血管平滑肌细胞，不知怎么的最近的细胞消化传代后很难贴壁，慢的要3天才能贴壁，有哪位高手可以指点一下，我真是困惑呀，万分感激！

作者: TAT 时间: 2014-8-2 17:40

我想买人大隐静脉平滑肌细胞，请问有买过的吗？

作者: rxcc33 时间: 2014-8-2 17:40

我现在在养兔平滑肌细胞，做了几次都不见组织块周围有细胞爬出，而且可见组织块周围有类似水晕的一圈，请教有谁知道是怎么回事吗？

作者: ujne 时间: 2014-8-2 17:41

刚巧手头上有这种菊花状的形状。大伙一起看看是不是呢？:I
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这个是细胞长得太满，挤成这样的吧，我也遇到过这种情况，一般这时候就要传代了。不知道平滑肌长得很好时，峰谷状是啥样啊!

作者: misswu61 时间: 2014-8-2 17:41

即将进入实验室，培养小鼠血管平滑肌细胞，看了大家的讨论，让我学会很多...谢谢

作者: baidukk 时间: 2014-8-2 17:42

请问组织块往培养瓶上贴要怎么贴才能贴的好呢？

作者: DNA 时间: 2014-8-2 17:42

我养了一周了，还是没见到细胞游出来，见到有几块组织浮起来了，但是培养基颜色正常，该怎么换液？？

作者: 莲花白 时间: 2014-8-2 17:42

原来的液体可以吸弃一半留一半，再加入吸弃量的新鲜培养液

作者: 莲花白 时间: 2014-8-2 17:43

我养的平滑肌细胞现在传代的，都不像最初的那个样子了，上图大家看看，这还是平滑肌细胞吗，亦或这又是什么呢，会成网状的

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作者: misswu61 时间: 2014-8-2 17:43

我养的平滑肌细胞现在传代的，都不像最初的那个样子了，上图大家看看，这还是平滑肌细胞吗，亦或这又是什么呢，会成网状的
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看了你的照片了，我养出来的细胞在形态上跟你的差不多，你做过鉴定没有啊？

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