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标题: 【讨论帖】单克隆抗体药物的质量检测 [打印本页]

作者: 耗子=== 时间: 2014-8-6 21:42 标题: 【讨论帖】单克隆抗体药物的质量检测

最近因为项目合作关系，看了很多抗体的糖基化和质量检测方面的文献，收获真的是很大，看我们生物制药版的人气真是不旺，所以发点心得和收获。当然还有一个目的就是希望能够把真正懂得人给挖出来，大家能够像别的版里一样，互相交流。
首先是一个抗体药物的release lots test：
?Protein Concentration ----------------------70.9 mg/mL [63.0 -77.0]
? Potency ---------------------- 100% [80 -125%]
? ID (immunoassay) ---------------------- Pass
? SE-HLC ----------------------- MP: 99.8 %, HMW: 0.2 %, LMW: 0.0% [MP ≥ 99 %]
? CE-SDS,reduced ----------------------HC+LC: 98.9 %, HC: 66.8 % LC: 32.1 % [LC+HC ≥ 98%]
? CEX-HPLC ----------------------- MP: 89.6 %, Acidic: 2.7 %, Basic: 7.7 % [≥ 80%]
? CEX-HPLC ID ----------------------- Pass
? Osmolality ----------------------- 314 mOsm/kg [300 ± 50]
? pH ---------------------- 5.2 at 24.6°C [5.0 – 5.4]
? Appearance ----------------------- Report
? Volume ----------------------- 1.2 mL (average 1.1525 mL, n = 5) [≥ 1 mL]
? Sub-visible Particulate ---------------------- 29 particles/container ≥ 10 μm [no more than 6000]
3 particles/container ≥ 25 μm [no more than 600]
? Sterility -------------------------------------- Pass
? Bacterial Endotoxin ----------------------- < 0.2 EU/mL [≤ 5.0]
? CHOP ELISA ----------------------- 4.4 ppm
? Protein-A ELISA -----------------------< 0.5 ppm
? DNA QPCR ----------------------- < 1pg/mg
以上各项指标基本是反映了对抗体药物最终产品的质量要求，用到的一些方法也比较的明了，可以作为抗体药物开发的参考。

作者: zhenxin 时间: 2014-8-6 21:44

这个只是检测结果，不是质量标准吧？

作者: #问号# 时间: 2014-8-6 21:45

严格的讲，质量标准是检测方法和检测指标的组合物。
有些公司图省事，也把简单指标列一列，作为质量标准的。

作者: seagate 时间: 2014-8-6 22:19

说实话，标准这个东西，
如果讨论格式
中文就看中国药典3部
国外就看EP/USP就可以了
如果要讨论研究技术，ICH Q6A和Q6B，才是研究的核心
当然，《药品标准工作手册》和EP的那些技术指南，都是很有帮助的。
讨论格式，真的很小儿科了。

作者: seagate 时间: 2014-8-6 22:21

QUOTE:

原帖由 kent 于 2014-8-6 22:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

这一点，不敢苟同，想与版主交流下。
这里面涉及到一个critical quality attributes的概念。多数抗体药物是九十年代末上市的，究竟哪些质控点影响临床疗效，哪些会造成免疫反应。在业内并没有公论。FDA只说，就事论事，CASE by ...

我还是认为，对于一个深入研究生物制药的人而言，这不是什么问题。这是一个基本问题。
因为我研究生物制药很少，也就根据自己看法，大概说一说。
如下指南和指导原则，如果大部分看了，应该对建立抗体类药物的思路，较清晰了。
1-cde《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则2003》
2-EP7《monoclonal antibody for human use》
3-ICH Q6B《测试方法和接受标准：生物技术和生物药品》
4-FDA《Assay Development for Immunogenicity Testing of Therapeutic Proteins》
5-FDA《Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use》
怎么说呢，我认为如果把ICH Q6研究透彻了

作者: qianqin1977 时间: 2014-8-6 22:22

这个帖子好啊，想请教下生物制品质控要求中对生产过程中的控制在这里怎么体现出来的呢？

作者: minran_1980 时间: 2014-8-6 22:25

简单说几句：
Protein concentration：通常采用分光光度法，前提是知道280nm转换因子。lowry法准确性和方法稳定性稍差。
Potency : 一般不能基于ELISA结果，至少得基于细胞学试验结果，流式细胞结合活性一般也不能完全代表Potency。
ID (Immunoassay)：一般没有必要了，因为其他很多试验都间接代表了鉴别。
Sub-visible particles: 不溶性微粒，2010年版中国药典三部标准是不大于6000粒/瓶（不大于10um）和不大于600粒/瓶（不大于25um)
此外，如果作为药品，每年至少应该测一次N末端氨基酸序列。

作者: 耗子=== 时间: 2014-8-6 22:26

这个只是产品的检测指标，检测方法buddesus 和horizon801的解释结合起来真是非常精彩，真没想到这个帖子揪出来这么多牛人。前段时间有人请教release lot test 是什么意思，呵呵，这个是不是很好的解释？
这些检测指标后面还有一大堆的东西，如何能够获得合格的产品还需要前期很多控制工作，我想这个应该是更加重要的，除了产品本身，细胞基质的检测以及控制也很重要。希望我们以此为基础，慢慢的摊开来，分别讲讲，我觉得比一个人闷头看文献好多了。

作者: 阿k 时间: 2014-8-6 22:29

Sub-visible Particulate ---------------------- 29 particles/container ≥ 10 μm [no more than 6000]
这个不知道业内怎么称呼？求解。
次级可见异物？该纸包应该与溶解性和澄清度相关。
另外，楼主公布的只是你公司所作抗体项目的检测项目和检测结果。不过确实有一定参考意义

作者: babybabe 时间: 2014-8-6 22:29

对于生物制品而言，过程控制比最终产品的控制更重要。
horizon801楼上楼主既然用细胞培养，缺乏病毒学方面的检验，我认为是不够的。

作者: zbboom 时间: 2014-8-6 22:30

楼主写的其实是一个lot release test 的指标及检测方法。蛋白药物质量控制包括drug subtance的lot release test和characterization，以及drug product的lot release test等多个方面。characterization方面所要做的检测项目要比lot release test的项目多很多，如下图所述：
我在做一个做抗体仿制药项目，对于drug subtance characterization的质量标准如何确定的问题，比较困惑。比如脱氨基、氧化，在做质量分析的时候需要做到什么程度不好把握。关于抗体糖基化的问题，更是复杂，需要测定其糖链结构，糖型分布等。做仿制药的时候，需要与标准品做对比，像这些指标，不可能与标准品完全相同，那么多大差异是可以接受的？这个具体的质量标准如何确定？
做仿制药关键是与标准品做对比，那么在质量控制上，首先是需要知道原研药（即标准品）的质量标准，但是原研药的质量标准是不公开的，那么就需要自己通过对原研药进行质量分析，来确定其质量标准。这个时候存在的一个主要问题是：选用怎样的检测方法和测定哪些指标？比如我们用还原性的毛细管电泳测定标准品和自己的产品中非糖基化的重链的含量时，发现我们自己表达的抗体，非糖基化重链含量偏高。这个时候问题就来了：我自己的产品，其非糖基重链含量控制在多大的水平是可以接受的？另外原研药适合上市很久的药了，其当初在报批上市的时候，质量控制可能没有用到高效毛细管电泳的技术手段，那么我做仿制药的时候，是否也可以不用这个手段来测定，而采用SDS-PAGE来做？SDS-PAGE的检测灵敏度要差很多，这样的话基本掩盖了糖基化差异。
就以上问题，还望各位大虾不吝赐教！

图片附件: 57129036.snap.jpg (2014-8-6 22:30, 68 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=26236

作者: damingxia0904 时间: 2014-8-6 22:33

标准提高是没有问题的，但是降低是不可以的，我们现在已经考虑用毛细管电泳取代常规的SDS-PAGE，这也是与国际接轨的一大提高，甚至毛细管等点聚焦也要进行定标准。

作者: 药徒 时间: 2014-8-6 22:35

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图片附件: 99409556.snap.jpg (2014-8-6 22:35, 49.7 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=26237

作者: lagua123 时间: 2014-8-6 22:36

严格的讲，质量标准是检测方法和检测指标的组合物。

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这是很正确的，有高度。
所以是否是仿制还是新药，已经成熟的新技术（特别是质控检测技术），肯定要代替老技术；特别是对于生物药，仿制是要仿它的产品，不是仿其技术，原研时代所采用的过时的技术，一定要去仿？没有道理嘛。许多制造技术细节是专利不载明的，也仿不到。
characterization, 不能理解为仅仅是临床前研究所必须的或者所看重的。不是每批产品释放都要做的一些项目，肽图啊、氨基酸测序啊等等，也是有规定在一定的生产周期必须要验证一次的，当然不同项目的验证周期可以不一样。
哪些质控项目是要批批检定，哪些又是可以一段生产周期做一次检定，应该是看在工艺条件下（发酵培养和纯化——对于原料而言），哪些质控项目批次间会有变异或者变异度比较大。比如肽图和氨基酸序列，基因不变异，应该就不会批次间有差异。
生物性的东西，稳定性很重要，包括基因、质粒、菌株或者细胞株。在生产单位，这些东西的稳定性考察，其管理应该有相应的制度和规程来规定，比如菌种库（细胞库）管理制度，按规定得定期要去做一些相关的质控检定，项目可能甚至会包括遗传背景，但肯定要包括表达水平，表达产物的一些重要的Characteristics。

作者: lagua123 时间: 2014-8-6 22:37

对于生物制品而言，过程控制比最终产品的控制更重要。
楼上说的case by case非常在理。
楼主既然用细胞培养，缺乏病毒学方面的检验，我认为是不够的。

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非常赞同，生物药的质量保证主要是工艺的过程控制，其实工艺就是产品，分析质控是工艺稳定性的有效保障手段。
除病毒验证都是由中检所来做的。公司都是提供样品和已选好型号的除病毒滤器。

作者: nikun230 时间: 2014-8-6 22:39

关于仿制药的性质研究方面的问题我个人认为主要分为以下几个部分，首先是对自己产品的基本理化性质进行深入全面的鉴定，然后将自己的产品与原研厂的产品进行比较研究，找出相同和不同，最后针对不同的地方结合临床前与临床研究进行综合考察，说明这些不同不会对产品的有效性和安全性造成影响。
至于多大的差异可以接受，首先需要确定你的工艺是否稳定，工艺不稳定，不管什么样的差异都很难说服CDE。工艺稳定之后，通过多批次样品的比较久可以指导因为工艺的因素可能会对样品的性质造成多大的波动，再结合检测过程本身的误差，从而知道这种差异是由于工艺和检查造成的还是产品本身就是与原研厂的不同。如果确实不同则需要分析这个不同之处是否会对产品的理化性质造成显著影响，根据其影响的严重程度则可以设计相应的细胞学、临床前或动物实验来分析其生物学活性、药效、药代动力学是否有显著差异。如果其活性或药代出现显著变化，则这个差异通常是不被允许的，如果没有，则可以与CDE进行沟通。生物仿制药很难和原研产品完全一致，比如糖基化的情况几乎和原研厂不可能一致，这就需要从各个方面来对其最终的安全性和有效性进行充分的说明。

作者: 耗子=== 时间: 2014-8-6 22:41

根据我们最近相关项目的进展情况，个人觉得在立项初期对原研药进行比较详细的分析是非常重要的，最好的是能买几个批次的产品，大概分析一下原研药的差异范围。在确定细胞株时非常重要的一点是与原研药在活性和理化性质（我们这边比较重视电荷差异和糖基化差异）的最大相似性，具体相似到什么程度，我觉得最起码峰的数量不要有差别，比例的话这个也真是说不好。之所以说细胞株很重要是因为我们这边之前有一个项目，选定的细胞株理化性质与原研药有差别，但是工艺优化了好久还是没有什么作用，最后只好选择沟通，解释了，很无奈

作者: 小糖块 时间: 2014-8-6 22:41

人源化/嵌合单抗的质量标准--检定项目
原液：
蛋白质含量、生物学活性、结合活性、SDS-PAGE、HPLC、等电点、相对分子质量测定、肽图、宿主DNA残留量、宿主蛋白残留量、蛋白A残留量、N-端氨基酸序列、其他杂质残留
成品：
外观、装量检查、水分测定（冻干制品）、pH、蛋白质含量、生物学活性、结合活性、无菌试验、异常毒性（豚鼠、小鼠）、热原质试验、内毒素

作者: 小糖块 时间: 2014-8-6 22:45

鼠源性单抗的质量标准--检定项目
原液：
蛋白含量、活性测定、SDS-PAGE纯度、HPLC纯度、等电点、其他杂质残留、组织交叉反应性测定
成品：
外观、水分测定（冻干制品）、pH、蛋白质含量、活性测定、HPLC纯度、异常毒性（豚鼠、小鼠）
来源：生物技术药物研究开发和质量控制王军志主编第二版科学出版社

作者: nikonun 时间: 2014-8-6 22:45

本人对生物制品不甚了解，最近碰到质量标准方面的问题，很想详细了解下其中的具体分析方法以及相应的原理，不知道各位专业人士有没有相关的书籍可以推荐？先谢了！

作者: glass 时间: 2014-8-6 22:48

如何更好的查询抗体原研药的相关信息？有高手能分享一下吗？

作者: glass 时间: 2014-8-6 22:49

谈下自己对这个标准的认识，可能有不对的地方。请指正！
?Protein Concentration ----------------------70.9 mg/mL [63.0 -77.0] 该项目是检测蛋白浓度，可以用常规的
Folin－酚试剂法（Lowry法），因为测定是总蛋白浓度，所以不能作为鉴定、生物活性的评判
? Potency ---------------------- 100% [80 -125%] 该项目主要针对抗体药物的生物活性，可以用ELISA，或其他基于细胞的检测方法。
? ID (immunoassay) ---------------------- Pass 鉴定项目使用了免疫学方法，目前最简便、快捷的当属ELISA，其原理是特异性的抗原-抗体结合作用。
? SE-HLC ----------------------- MP: 99.8 %, HMW: 0.2 %, LMW: 0.0% [MP ≥ 99 %] 该项目俗称纯度，主要是为了检测制剂中的聚体（HMW 大分子物质），降解（LMW 小分子物质）。
SE-HLC应为 SE-HPLC即分子筛，这种方法能够根据分子量进行分离。但是，若要重点分析聚体，SE-HLPC也有其局限性。
? CE-SDS,reduced ----------------------HC+LC: 98.9 %, HC: 66.8 % LC: 32.1 % [LC+HC ≥ 98%]
CE是毛细管电泳；reduced是还原，能够打开轻链、重链。目前，国内用的较多的还是SDS-PAGE，毛细管电泳一般生产厂家购买的不多。后者与前者相比，在于能够高通量、更为精确、快速！
? CEX-HPLC ----------------------- MP: 89.6 %, Acidic: 2.7 %, Basic: 7.7 % [≥ 80%]
该项目是使用阳离子交换色谱检测主带、酸性变异、碱性变异的比例。这其实关注的是，抗体的电荷变异。这里多说一点，多种化学修饰都会引起抗体分子等电点的改变。如抗体分子的脱酰胺化、唾液酸化、重链C段赖氨酸清除造成偏酸电荷变异，赖氨酸/甘氨酸酰胺化反应、甲硫氨酸氧化作用等碱性电荷变异143（该文尚未发表）
? CEX-HPLC ID ----------------------- Pass
同上，用于鉴定
? Osmolality ----------------------- 314 mOsm/kg [300 ± 50]
这是渗透压，影响该项目的主要是制剂配方。
? pH ---------------------- 5.2 at 24.6°C [5.0 – 5.4]
不说了。
? Appearance ----------------------- Report
外观，不说了。
? Volume ----------------------- 1.2 mL (average 1.1525 mL, n = 5) [≥ 1 mL]
不说了。
? Sub-visible Particulate ---------------------- 29 particles/container ≥ 10 μm [no more than 6000]
这个不知道业内怎么称呼？求解。
3 particles/container ≥ 25 μm [no more than 600]
不说了。
? Sterility -------------------------------------- Pass
无菌，不说了
? Bacterial Endotoxin ----------------------- < 0.2 EU/mL [≤ 5.0]
内毒素，多用鲎试剂法
? CHOP ELISA ----------------------- 4.4 ppm
宿主蛋白，ELISA测定
? Protein-A ELISA -----------------------< 0.5 ppm
protein A 是纯化的第一步，可能有泄漏的可能，所以也要检测。
? DNA QPCR ----------------------- < 1pg/mg
宿主DNA，不说了，做重组蛋白药的都要测。
以上各项指标基本是反映了对抗体药物最终产品的质量要求，用到的一些方法也比较的明了，可以作为抗体药物开发的参考。
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鉴别试验应该是鉴别本生产地址生产的所有药品。因此，如果你只做一个产品，那么做ELISA就OK了。如果做多个单抗，建议做肽图，这是鉴别的真正含义。个人愚见

作者: glass 时间: 2014-8-6 22:50

人源化/嵌合单抗的质量标准--检定项目
原液：
蛋白质含量、生物学活性、结合活性、SDS-PAGE、HPLC、等电点、相对分子质量测定、肽图、宿主DNA残留量、宿主蛋白残留量、蛋白A残留量、N-端氨基酸序列、其他杂质残留
成品：
外观、装量检查、水分测定（冻干制品）、pH、蛋白质含量、生物学活性、结合活性、无菌试验、异常毒性（豚鼠、小鼠）、热原质试验、内毒素
......

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结合活性是指抗原和抗体的结合力吗？如何测定呢？单抗测定了生物学活性还要测定结合活性？？

作者: 大白菜 时间: 2014-8-6 22:51

根据我们最近相关项目的进展情况，个人觉得在立项初期对原研药进行比较详细的分析是非常重要的，最好的是能买几个批次的产品，大概分析一下原研药的差异范围。在确定细胞株时非常重要的一点是与原研药在活性和理化性质（我们这边比较重视电荷差异和糖基化差异）的最大相似性，具体相似到什么程度，我觉得最起码峰的数量不要有差别，比例的话这个也真是说不好。之所以说细胞株很重要是因为我们这边之前有一个项目，选定的细胞株理化性质与原研药有差别，但是工艺优化了好久还是没有什么作用，最后只好选择沟通，解释了，很无奈
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你的细胞株的理化性质，具体是指什么？是用了不同的细胞株吗？比如原研药是用CHO，而你用的是293?

作者: huifeng0516 时间: 2014-8-6 22:55

到底是原研还是生物仿制药？如果是后者，那就是case by case 了，唯有检测项目值得参考。质量研究是必须的,但更重要的是potency以及safety.如果是生物仿制药，还要再加上similarity.

作者: newway 时间: 2014-8-6 22:56

? Sub-visible Particulate ---------------------- 29 particles/container ≥ 10 μm [no more than 6000]
次级可见颗粒物?

作者: sunbent 时间: 2014-8-6 22:57

QUOTE:

原帖由 newway 于 2014-8-6 22:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

? Sub-visible Particulate ---------------------- 29 particles/container ≥ 10 μm [no more than 6000]
次级可见颗粒物?

不溶性微粒

作者: zsxan1990 时间: 2014-8-6 22:57

我们现在做单抗药物，发现用SEC的方法检抗体的降解产物局限性较大啊，如果只是抗体的几个基团被氧化或者破坏（比如加热和氧化剂破坏），SEC较难分开杂质啊，用C柱和离子柱拖尾又特别严重，请教各位高手有没有好的意见？

作者: gemei0115 时间: 2014-8-6 22:59

我们现在做单抗药物，发现用SEC的方法检抗体的降解产物局限性较大啊，如果只是抗体的几个基团被氧化或者破坏（比如加热和氧化剂破坏），SEC较难分开杂质啊，用C柱和离子柱拖尾又特别严重，请教各位高手有没有好的意见？

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SEC由于材料的限制，目前主要用于高分子杂质的检测；而对于降解或者氧化产物，更多的选择反相、离子交换色谱或高分辨率的毛细管电泳来进行常规研究（拖尾的话，只能说明方法需要优化），有条件的企业会用到LC-MS或LC-MS-MS进行研究，具体的细节就只能按样本讨论了

作者: 耗子=== 时间: 2014-8-6 22:59

最近又有一个经验分享，同样是CHO细胞，CHO-K1和CHO-dhfｒ由于筛选和培养体系不同势必会对影响产品的翻译后修饰有影响，理化性质一定会有差异的。所以最好在仿的同时连同筛选体系也相同，会减少很多差异性，增加相似性

作者: 耗子=== 时间: 2014-8-6 23:00

我们现在做单抗药物，发现用SEC的方法检抗体的降解产物局限性较大啊，如果只是抗体的几个基团被氧化或者破坏（比如加热和氧化剂破坏），SEC较难分开杂质啊，用C柱和离子柱拖尾又特别严重，请教各位高手有没有好的意见？

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使用毛细管电泳试一试。

作者: dreaming 时间: 2014-8-6 23:02

有没有测过三维构象呢，三维构象的改变也会导致仿制药与原创药的差异。

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