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标题: 【求助】PCR扩增没有条带，或条带特别弱 [打印本页]

作者: she 时间: 2014-8-30 15:40 标题: 【求助】PCR扩增没有条带，或条带特别弱

我以前用taq酶做pcr，条带挺亮的，现在用EX taq酶做条带特别暗，有的时候还扩不出来，我把模板亮加到5微没有太大改变，我的体系是引物1
+1，buffer 2.5，dntp0.5，,1.5,2都做过，酶0.3，模板3和5都做过，感觉变化不大

作者: rxcc33 时间: 2014-8-30 15:41

模板量有时侯太大，PCR扩增会出不来，降低模板量试试。

作者: rxcc33 时间: 2014-8-30 15:41

EXTaq不太好PCR扩增，你试一试加入少量Taq与EXTaq混合做一下。

作者: yueban-1147 时间: 2014-8-30 15:42

extaq酶的反应条件是不是要求比较高啊

作者: utt0989 时间: 2014-8-30 15:42

1. 你做PCR的模板是什么？cDNA还是基因组DNA呢

2. 你的模板加到了5微，那具体的量（ng）是多少呢？

3. 你的体系是体积，各成分的浓度是多大？

4. Extag还是相对容易扩出来的，扩增能力和你说的tag我觉得差不多，都是tag，就是保真性又提高了一点

作者: join 时间: 2014-8-30 15:43

这是做PCR中常见的问题，每个PCR体系中各组分之间都有一定的比例，与此同时最为关键的酶有没有问题，同实验室的可以相互借用一下试剂再做一次PCR对比一下。

作者: xiaoxiaoniao 时间: 2014-8-30 15:43

我最近也在用EX Taq鉴定重组DNA，感觉还是挺好出的，我的反应体系是50μl的

EX Taq Buffer  5
2.5mM dNTP 4
10mM 引物1 1.5
10mM 引物2 1.5
EX Taq          0.2
模版             100ng左右
水                X

反应条件
1， 94度 2min
2， 94度 30sec
3， 50度 30sec
4， 72度 kb／min（根据自己的片段长短）
2～4 重复30～35次
5， 72度 1min

不知道对你有帮助没。。。

作者: redbutterfly 时间: 2014-8-30 15:43

我最近也在用EX Taq鉴定重组DNA，感觉还是挺好出的，我的反应体系是50μl的

EX Taq Buffer 5

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请问 Ex taq酶和LA taq酶有啥区别啊？与普通PCR所用的taq酶有啥区别啊？谢谢

作者: she 时间: 2014-8-30 15:45

1. 你做PCR的模板是什么？cDNA还是基因组DNA呢

2. 你的模板加到了5微，那具体的量（ng）是多少呢？

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是CDNA，模板我做过梯度，2,4,5微全做了，但是没有太大变化

作者: she 时间: 2014-8-30 15:45

QUOTE:

原帖由 utt0989 于 2014-8-30 15:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1. 你做PCR的模板是什么？cDNA还是基因组DNA呢

2. 你的模板加到了5微，那具体的量（ng）是多少呢？

3. 你的体系是体积，各成分的浓度是多大？

4. Extag还是相对容易扩出来的，扩增能力和你说的tag我觉得差不多，都是tag，就是保真性 ...

是CDNA，模板我做过梯度，2,4,5微全做了，但是没有太大变化

作者: she 时间: 2014-8-30 15:46

QUOTE:

是cDNA,模板我做过梯度，1，2,4,5微都做过，但效果都不好，且1微没有出现条带，我用产物又扩增了一次，1微的出现了条带

作者: qhyu 时间: 2014-8-30 15:46

是cDNA,模板我做过梯度，1，2,4,5微都做过，但效果都不好，且1微没有出现条带，我用产物又扩增了一次，1 ...

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你的cDNA是从单一细胞系里面提取出来的吗，还是用的不同细胞系混合后的pool，建议都用几个细胞系或者组织的RNA，逆转录成cDNA作为模板，避免出现你要扩的基因的表达丰度在你选用的组织中很低

作者: bluelake 时间: 2014-8-30 15:47

请问 Ex taq酶和LA taq酶有啥区别啊？与普通PCR所用的taq酶有啥区别啊？谢谢

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这三种酶对DNA扩增的增幅有差异，普通的taq，扩增10K一下（貌似一般也就扩8k左右）；EX taq 的话根据TAKARA公司介绍，质粒DNA能扩增到20k，基因组DNA能扩增到17.5k；至于LA taq，高于前两者，主要应用于长链DNA的扩增，TAKARA公司做过实验，质粒DNA有可能扩增达到40k，基因组有可能达到30k。这是其一，其二，普通taq，虽然也具备3'→5'的错配修复外切酶活性，但是较EX和LA相比扩增链的错配率还是很高，TAKARA公司给出的实验结果是，如果普通taq的错配率是100%，那么EX的错配率为33%，LA的错配率为20%，根据不同的实验目的，可以选用不同的taq。
以上为我个人查找的资料后个人的理解，如有偏差，或误述，见谅。

作者: ending 时间: 2014-8-30 15:47

你的引物坏了吧？没有扩出来那么有没有引物二聚体出现呢？

作者: viviwang1987 时间: 2014-8-30 15:47

主还是把您所用各成分及浓度都列出来，我们才好参谋！不过1次，2次PCR不理想也属于正常情况。

作者: ALALA 时间: 2014-8-30 15:48

我觉得用的酶比较关键，再就是二次PCR试试

作者: she 时间: 2014-8-30 15:48

QUOTE:

原帖由 viviwang1987 于 2014-8-30 15:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主还是把您所用各成分及浓度都列出来，我们才好参谋！不过1次，2次PCR不理想也属于正常情况。

buffer 2.5, dNTP 0.5,1.5,2, 引物1+1，EX Taq 0.3，模板 1,2,3，4，5都做过，共25微。
条件：TOUCHDOWN:94度5min，94度30S，53度30S，72度1min10S，10循环，每个循环退火温度降0.5度
94度30S，46度30S，72度1min10S，30循环 72度5min
目的片段大小为1100bp左右

作者: she 时间: 2014-8-30 15:49

QUOTE:

原帖由 ending 于 2014-8-30 15:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你的引物坏了吧？没有扩出来那么有没有引物二聚体出现呢？

有二聚体，而且还特别亮

作者: hold住 时间: 2014-8-30 15:50

PCR反应主要由反应体系和反应程序决定，反应体系你可以参照标准体系微调，建议（25ul体系）：buffer 2.5ul,（Mg2+, 2ul）, dNTP 2ul, 引物各 0.4ul (25 pmol/ul)， Taq 0.2ul，模板 1ul, 用水补齐至25ul. 在体系中常做调整的成分是Mg2+用量（1.5~2.5ul）,模板。0.5~1ul. 反应体系一般为：94度4min，94度30S，53度（可变）30S，72度1min（可变），30循环，72度5min，10度保温。其中，退火温度和延伸时间根据目的条带调整，退火温度建议用梯度PCR确定，延伸时间大约1kb/min. 你在PCR扩增中用了降落PCR, 而降落PCR一般用于杂带去除，在此并不适用。建议：先检查所用试剂有没有问题，再核对各成分浓度及用量，然后确认程序。可以在前面问题排除的情况下，用普通程序做一下梯度pcr,模板可以先用之前扩增成功时的用量。

作者: cocacola 时间: 2014-8-30 15:50

最主要是退火温度，模板浓度不是主要影响因素，做一个梯度试一下

作者: cocacola 时间: 2014-8-30 15:51

脱货温度的梯度，而不是模板的梯度，还有，你的cDNA的完整性也是一个问题，最好有一个对照

作者: eric930 时间: 2014-8-30 15:52

有二聚体，而且还特别亮

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退火温度太低了，你把退火温度调到60度左右试试，虽然不知道你引物的tm，如果还扩不出来就重新设计引物吧

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