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标题: 【讨论帖】在安捷伦工作站上面进行同位素（及多离子加... [打印本页]

作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:35 标题: 【讨论帖】在安捷伦工作站上面进行同位素（及多离子加...

标签：化合物安捷伦色谱质谱气相色谱

在安捷伦工作站上面进行同位素（及多离子加和）内标曲线法定量过程简单介绍

先简单的回顾一下内标法，内标法就是在待测的样品中准确加入一定量的内标物，根据被测物和内标物的量及其在（在质谱中是质量色谱图）色谱图相应的峰面积比取出此被测定组分的含量。

样品中加入内标物，利用被测物与内标物校正因子的比值不变来进行定量的。

内标法的优点：

进样量不严格要求；内标的加入消除了由于进样量、仪器不稳定等因素带来的系统误差；只对欲分析的组分峰做校正。

内标法的缺点：

每次需要准确称量内标物和样品。

必须加一个组分进到样品，有可能增加面积测量误差。

作为内标的化合物其化学性质和保留时间最好都应和目标化合物相似（理想状态）。但它必须能按保留时间或 m / z 值来和样品区分。

同位素标记目标化合物是一个理想的内标物，它可以由其离子和目标化合物的M/Z值区别开。运用同位素标记化合物做内标物，其化学性质、色谱特性等都与目标化合物一致，因此校正精度更高。目标物和其同位素化合物的保留时间一致，单靠色谱是没有办法区分开的，而质谱有选择离子模式，可以很好的把目标物和其同位素标记物分离开来。

下面简单介绍一下在安捷伦的工作站上面进行同位素（及多离子加和）内标曲线法定量简单过程。

1 实验部分：

1.1仪器与装置

Agilent7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪，带有Gerstel的MPS-X多功能自动进样系统（顶空进样器）。

1.2标样和样品：

DMS （dimethyl sulfide）, 纯度：99%安谱公司（TCI）提供

d6-DMS (dimethyl-d6 sulfide), 纯度： 98.7% （NMR 99.7 atom % D）

样品：市场样品

1.3色谱条件色谱柱：DB-Innowax (Agilent)色谱柱(30m×0. 25 mm ( i.d.)×0.25μm)毛细管柱；

柱温：40℃保持10 min或更长

载气（He）流速1.6 mL/min，

进样口温度250℃，

分流比20:1,

1.4质谱条件电子轰击（EI）离子源，电子能量70eV；

传输线温度280 ℃；

离子源温度230 ℃；

四级杆温度，150℃。

SCAN扫描范围：29-400。SIM按化合物的特征离子设定。

1.5 进样方式

标样标液系列和样品置于多功能进样器的顶空进样装置上面。平衡时间：20min, 平衡温度：40℃，进样量1ml。当然可以用液体进样测定更容易简单些，或许准确性更高。这里是由于DMS（沸点37.5）度的挥发性较高而选用顶空测定。

作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:35

2 标准曲线的建立

和普通内标法曲线法的建立过程一样，先进样标准目标物和其同位素化合物，得到它们的保留时间，定量及特征离子等信息。也可以参考相关标准资料了解目标化合物和其同位素内标的定量或特征离子的相关信息。

下面是20ppm DMS水溶液（可能有点小，大点或许更好测）顶空测定的TIC和质谱图：

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作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:36

从上面看到 H3C-S-CH3(DMS)基峰是62 （分子峰），其它较大的离子有47, 45等。

（二甲基硫醚的α-裂解失去H，m/z61; 重要碎片是CH2=SH，m/z 47；CH2=S, m/z 46; CH≡S，m/z45）

下面是20ppm d6-DMS水溶液的TIC和质谱图：

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=26867

作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:36

从上面看到d-DMS(D3C-S-CD3)基峰是68（比DMS多6个amu），其它较大的离子有50, 46等。

六氘代二甲基硫醚的α-裂解失去D（D是2amu， H是1amu），m/z66; 重要碎片是CD2=SD，m/z 50；CD2=S, m/z 48; CD≡S，m/z46

本示例SIM中DMS选用62和47离子；d-DMS选用68和50离子进行扫描检测。大家可以根据自己的需要选择更多的离子来检测。扫描时间：2 – 10min或更长。如下图示例。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=26868

作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:36

配制20, 100, 500, 1000ppm的DMS和100ppm内标d-DMS的系列混合溶液，进样得到质谱数据。这里的系列仅作为示例（当然也是实际数据），您可以根据自己的需要来建立合适的曲线范围。

作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:37

调用其中某一数据文件，先把default.m改为（另存）为其它名称，例如dms.m或别的名称。

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作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:37

点击OK

积分并点击峰得到质谱图。

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作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:38

Calibrate----Set up Quantitation…（不能AutoQuant Setup，因为目标化合物和其同位素内标物的保留时间一样，自动校正曲线建立无法进行）。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=26871

作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:38

在calibrate title里面输入名称，例如DMS test。如果使用RTE积分，就在Use RTEINT前面打钩。如果使用ChemStation积分器，就去掉use RTEINT前面的√。这里用ChemStation积分器为例子，您可以根据个人的喜好选择自己常用的积分器。点Browse，选择events.e积分文件打开。

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作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:40

并输入浓度单位和内标量（根据实际量，后面内标量也是可以改的）。

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作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:40

Edit Compounds （编辑化合物）

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作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:41

点In sert Above, 放大色谱图，积分。先输入内标物的名称或代号，例如IS或d-DMS，在内标ISTD前面打勾。必须是先输入内标物，切记。

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作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:41

左右双键同时点击68离子及50离子，save

图片附件: 2013082923085207.jpg (2014-9-13 10:41, 70.8 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=26877

作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:41

在色谱峰（与刚才内标物的位置稍微不同一点位置）上面点击，再输入DMS名称，左右双键同时点击62和47离子，和内标物的方法相同。

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作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:42

Save （可以看到色谱图什么有两个加号）, Exit

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作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:43

Exit

File has been quan titated. Quan titate now? 点击Y。

作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:43

输入compouds Concentration （化合物浓度）, New Level ID（新级别号）里面输入级别号，例如20或其它代号。

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作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:45

Do up date （更新）

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作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:46

确定

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=26883

作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:46

点OK，Cur rent chan ges will be saved, Pro ceed? 确定。

用下面方法添加别的浓度，即先调用数据文件，积分，calibrate----up date （图中1）

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作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:47

Up date one level（图中2）----OK----Y（图中3）----Do up date （图中4）, 下面和第一个的建立过程一样。其它浓度的点也是一样来加入更新。最后就可以得到下面的校正曲线了。

图片附件: 2013082923363541.jpg (2014-9-13 10:47, 75.07 KB) / 该附件被下载次数 9
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作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:48

记住，方法必须再保持一次后退出，否则化合物列表可能会丢失。

图片附件: 2013082923370731.jpg (2014-9-13 10:48, 64.87 KB) / 该附件被下载次数 6
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作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:48

3 另外说一下多离子加和定量，比较简单（曾请教过别的网友），就是在Advanced菜单下面Q1，Q2, Q3前面选√。例如如果是选两个离子，就在Q1前面选√即可。

当然大家一般是选用单离子定量，这里只是一个示例而已，大家可以根据自己的需要确定选择一个或几个离子共同来定量。

图片附件: 2013082923392209.jpg (2014-9-13 10:48, 53.68 KB) / 该附件被下载次数 9
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作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:48

4 样品测定

在同样条件下测定条件下测定样品。选则未知样的MS数据，先需要在Edit Compounds（编辑化合物）里面的identifacatin菜单的sample ISTD concentrating（样品内标加入量）中输入实际内标加入量。用Quantitate/Calculate即可得到含量报告。（比较简单，就不多罗嗦了）

作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:49

Compound                R.T. QIon  Response  Conc Units Dev(Min)

--------------------------------------------------------------------------

Internal Standards

   1) d-DMS                      2.368 68 21514996+ 98.40 ppm    0.00

Target Compounds                                                 Qvalue

   2) DMS                      2.378 62 126716352+  670.49 ppm    89

--------------------------------------------------------------------------

(#) = qualifier out of range (m) = manual integration (+) = signals summed

注：这里的加号（+）是多离子加和的峰面积，不是手动的积分面积。

作者: uaubc 时间: 2014-9-13 10:49

内标法定量，介绍得很详细呢

作者: ha111 时间: 2014-9-13 10:54

以目标物的同位素作为内标物在定性上更加有优势，可以以两者的分辩率作为一个定性观察因素，当在GC比GCMS上更好的定性确认作用。

作者: 浪子 时间: 2014-9-13 10:54

原创很详细，峰型也漂亮。

作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:55

以目标物的同位素作为内标物在定性上更加有优势，可以以两者的分辩率作为一个定性观察因素，当在GC比GCMS上更好的定性确认作用。

===================================================

用目标物的同位素作为内标物在定性还没有用过，应该是个不错的办法。

作者: dodoit 时间: 2014-9-13 10:56

不知道岛津的气质有没提供这种选择。。。

作者: junhun 时间: 2014-9-13 10:56

同位素内标物色谱无法分开吗？

作者: toy 时间: 2014-9-13 10:57

我们平时测试的硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的响应很低，20mg/L基本都找不到峰，您测试的曲线浓度是多大的啊？我们使用的是岛津的GCMS，DB-WAX色谱柱。

没有测定过硫酸二甲酯和硫酸二乙酯，我上面这个DMS的顶空样品检测限是1ppm（实际还要低，大致0.05ppm，因为样品和标样均稀释20倍，这个我也没有想到的会这么低）。

作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:57

同位素内标物色谱无法分开吗？

===================================================

对，化合物和其同位素的色谱保留是一样的，在色谱上是无法分离的。

作者: 浪子 时间: 2014-9-13 10:58

QUOTE:

原帖由 zbs 于 2014-9-13 10:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
同位素内标物色谱无法分开吗？

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对，化合物和其同位素的色谱保留是一样的，在色谱上是无法分离的。

我们做多环芳烃的时候，为什么同位素内标是可以分开的？

作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:58

QUOTE:

原帖由浪子于 2014-9-13 10:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我们做多环芳烃的时候，为什么同位素内标是可以分开的？

这个还真不知道，我没有遇到过，请问保留时间能相差多少？不会是凝胶色谱柱分离吧？

作者: 浪子 时间: 2014-9-13 10:59

QUOTE:

原帖由 zbs 于 2014-9-13 10:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

这个还真不知道，我没有遇到过，请问保留时间能相差多少？不会是凝胶色谱柱分离吧？

是GC-MS做的，用的是多环芳烃专用色谱柱。保留时间相差不多，但是能够明显分开。

作者: zbs 时间: 2014-9-13 10:59

QUOTE:

原帖由浪子于 2014-9-13 10:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

是GC-MS做的，用的是多环芳烃专用色谱柱。保留时间相差不多，但是能够明显分开。

专用柱这么厉害，能不能上张图，让见识一下？我看到一些文献的多环芳烃的色谱分离，均未分开，只看到一例其中有XX.65min和XX.66min的差别。

作者: 浪子 时间: 2014-9-13 11:00

QUOTE:

原帖由 zbs 于 2014-9-13 10:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

专用柱这么厉害，能不能上张图，让见识一下？我看到一些文献的多环芳烃的色谱分离，均未分开，只看到一例其中有XX.65min和XX.66min的差别。

我们不只这么小的区别。我找个时间拍张图片给你看看。

我们用的是这种柱子：

Stationary Phase

Part No.

ID (mm)

Length (m)

Film (mm)

Temp Limit (°C)

DB-EUPAH

121-9627

0.18

20

0.14

40 to 320/340
cuturl('http://www.chem.agilent.com/zh-CN/Products/columns-supplies/gc-gc-mscolumns/db-eupah/Pages/default.aspx')

作者: zbs 时间: 2014-9-13 11:00

QUOTE:

原帖由浪子于 2014-9-13 11:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我们不只这么小的区别。我找个时间拍张图片给你看看。

我们用的是这种柱子：

Stationary Phase

Part No.

ID (mm)

Length (m)

Film (mm)

Temp Limit (°C)

DB-EUPAH

121-9627

0.18

20

0.14

...

好的，谢谢，期待中。这个柱子我知道。

作者: 浪子 时间: 2014-9-13 11:01

两张图是同一个样品。

图1：第一个峰是萘的同位素内标萘D-8，第二个峰是萘。

图片附件: 2013090922554454.jpg (2014-9-13 11:01, 110.71 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=26888

作者: 浪子 时间: 2014-9-13 11:01

图2：萘D-8保留时间是3.583min，萘的保留时间是3.620min。

图片附件: 2013090922563483.jpg (2014-9-13 11:01, 138.13 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=26889

作者: 66小飞侠 时间: 2014-9-13 11:02

QUOTE:

原帖由浪子于 2014-9-13 11:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

图2：萘D-8保留时间是3.583min，萘的保留时间是3.620min。

非常感谢提供图谱。千层峰版主也说做PAH用萘D8做内标，萘峰和N萘D8 能分开，但分开的不好。今天终于看到图谱了。

作者: 浪子 时间: 2014-9-13 11:03

QUOTE:

原帖由 66小飞侠 于 2014-9-13 11:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

非常感谢提供图谱。千层峰版主也说做PAH用萘D8做内标，萘峰和N萘D8 能分开，但分开的不好。今天终于看到图谱了。

这根柱子是旧柱子，峰有点拖尾，如果是新柱子的话，分离应该会更好些。

作者: vvmmoy 时间: 2014-9-13 11:04

这个定量是个不错的选择，我们现在做邻苯就是采用这种方法的

作者: 浪子 时间: 2014-9-13 11:04

QUOTE:

原帖由 vvmmoy 于 2014-9-13 11:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
这个定量是个不错的选择，我们现在做邻苯就是采用这种方法的

就是感觉邻苯同位素贵。

作者: kswl870 时间: 2014-9-13 11:05

是的哦，昨天看到一本杂志上有人用GC-QQQ做邻苯，可以不用同位素内标，不知道是不是真的，等机器到了试试看

作者: uuooii 时间: 2014-9-13 11:05

纠正楼主一个小错误。
Agilent的ＧＣ中 7890只有A或者B； 6890才有Ｎ啊。

作者: 浪子 时间: 2014-9-13 11:06

纠正楼主一个小错误。
Agilent的ＧＣ中 7890只有A或者B； 6890才有Ｎ啊。

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谢谢细心发现错误，笔误，明显错误，确实是7890A。

作者: 831226 时间: 2014-9-13 11:09

好像内标可以最后再修改。

作者: dragonkilly 时间: 2014-9-13 11:09

请教楼主：
说下您的标线的标样的配制步骤，达到差不多4个9了

作者: 浪子 时间: 2014-9-13 11:18

QUOTE:

原帖由 dragonkilly 于 2014-9-13 11:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教楼主：
说下您的标线的标样的配制步骤，达到差不多4个9了

我是配制20, 100, 500, 1000ppm的DMS和100ppm内标d-DMS的系列混合溶液，用德国一款进口的容量瓶（塞子互用，不漏），一般我用50ml和10ml容量瓶。配制过程和大家是一样的，逐步稀释，没有什么特别。就是注意由于其挥发性，室温不能高，及时盖好盖子。可能由于是内标法，线性较好。另外仪器稳定，参数尽量设置合理。

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