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标题: 【求助】荧光定量PCR阴性对照峰值和样品一样 [打印本页]

作者: 简森si 时间: 2014-9-25 11:02 标题: 【求助】荧光定量PCR阴性对照峰值和样品一样

是荧光定量pcr的图，加粗的是阴性对照，SYB染料、水和引物。第一张图峰值和我的样品差不多，确定没有加CDNA。我的CDNA样品也跑了很多基因了，没遇到这样的情况，请教一下各位前辈，肿么回事啊？

作者: huifeng0516 时间: 2014-9-25 11:02 标题: 回复 #1 简森si 的帖子

很明显是污染了检测基因的模板，有可能是你的cDNA模板，也有可能是之前的PCR产物。

作者: eric930 时间: 2014-9-25 11:03

很明显,引物污染了模板.... 对了，请问你的用的可是天根的sybr1 mix 试剂？？

作者: 简森si 时间: 2014-9-25 11:03

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很明显,引物污染了模板.... 对了，请问你的用的可是天根的sybr1 mix 试剂？？

TAKARA

作者: 简森si 时间: 2014-9-25 11:03

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我确定我阴性对照加的是水。

作者: eric930 时间: 2014-9-25 11:03

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我确定我阴性对照加的是水。

没错,你用水代替了模板,但是你的引物污染进了模板嘛... 这样你模板用水也没用是吧?

作者: 简森si 时间: 2014-9-25 11:04

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没错,你用水代替了模板,但是你的引物污染进了模板嘛... 这样你模板用水也没用是吧?

那我换一组八联管？

作者: eric930 时间: 2014-9-25 11:04

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那我换一组八联管？

额...... 是换没被污染的引物..... 如果还有引物干粉，那就重新用干净的水去溶。。。。

作者: koook5695 时间: 2014-9-25 11:05

以将试验完的体系跑个2%的琼脂糖凝胶看看嘛，看有无条带。另外，扩增曲线中我认为阴性对照所在的位置也算正常，因为到达阈值的ct值已经到了35左右了，可以忽略了。融解曲线中阴性对照在左边，说明即算有产物条带大小也小于其它样本产物，不知道是不是引物二聚体。

作者: wiwi 时间: 2014-9-25 11:05

我来回复楼上所有人的疑问：对于一个每天都要做几十管PCR和众多的不同基因的人。到目前为止我估计做了至少5w管各种PCR反应的经验来说。用sybr green 1 来做定量PCR总是空白对照阴性对照会在35左右翘尾巴，是正常现象。sybr green 1 最总要的是看溶解曲线。所有我不建议做用染料来做的定量。要定量最好还是用taqman法。所有做阴性对照和空白对照的电泳结果都是在100bp以下会出现淡淡或者很亮的条带都是正常，这是引物2聚体和一些非特异性扩增的片段。这就解释了sybr green 1为什么空白最后会有翘尾巴。

作者: zhenxin 时间: 2014-9-25 11:06

加样的时候的问题，质粒模板很容易飞起来到处飘的。
阴性对照30多圈的ct值可以用的。

作者: whitesheep 时间: 2014-9-25 11:06

我这做实时荧光pcr 进程96孔在一个管架上，有时有阳性样品有时有阴性有时到最后加阳性质粒加完再盖盖子污染真没大家想象中的可怕，污染都是百分之5左右。但是你最好加样加模板不要在室内加。在室外加。

作者: zhenxin 时间: 2014-9-25 11:07

很明显是污染了检测基因的模板，有可能是你的cDNA模板，也有可能是之前的PCR产物。

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