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标题: 【求助】关于pcr条带不亮的问题 [打印本页]

作者: ilovegaga 时间: 2014-10-7 10:37 标题: 【求助】关于pcr条带不亮的问题

pcr条带不亮，做了好多次了，纠结。求大神指点...
用cDNA为模板，P出目的片段，不亮。然后用P出的目的片段为模板，0.5ul，P出的条带还是不亮，貌似出现严重的引物二聚体。要做切胶回收。
两种模板都做过梯度，还是不亮！增加了到35循环，不亮！
反应条件：
94℃ 5min
94℃ 30s
45℃-59℃ 30s（梯度）
72℃ 1.5min
72℃ 10min
4℃ 1h
25ul体系
求大神指点...

作者: u76mp 时间: 2014-10-7 10:37

第一次PCR产物浓度底无需回收。。直接当模版就可以了
第一次PCR没有二聚体。。二次有二聚体。。。
二次有改变温度？。。。。。

作者: ilovegaga 时间: 2014-10-7 10:37

QUOTE:

原帖由 u76mp 于 2014-10-7 10:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

第一次PCR产物浓度底无需回收。。直接当模版就可以了
第一次PCR没有二聚体。。二次有二聚体。。。
二次有改变温度？。。。。。

第一次的没回收，第二次以第一次的pcr产物为模板，还是用第一次的梯度P的，结果二次扩增有引物二聚体

作者: feima+ 时间: 2014-10-7 10:38

QUOTE:

原帖由 ilovegaga 于 2014-10-7 10:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

第一次的没回收，第二次以第一次的pcr产物为模板，还是用第一次的梯度P的，结果二次扩增有引物二聚体

第一图是第一次梯度？？为啥就3个样？？
你第一次用梯度P。。第二次就不需要了。。。根据梯度结果。。你应该可以确定哪个温度。。。。
引物多少uM??
用10ul体系，
温度分45，48，52，55，58
引物用4uM
试看看

作者: ilovegaga 时间: 2014-10-7 10:38

QUOTE:

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第一图是第一次梯度？？为啥就3个样？？
你第一次用梯度P。。第二次就不需要了。。。根据梯度结果。。你应该可以确定哪个温度。。。。
引物多少uM??
用10ul体系，
温度分45，48，52，55，58
引物用4uM
试看看 ...

第一的梯度P出来，但是不亮。

作者: ilovegaga 时间: 2014-10-7 10:39

QUOTE:

20uM

作者: feima+ 时间: 2014-10-7 10:39

QUOTE:

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20uM

第一次PCr
用10ul体系，
温度分45，48，52，55，58
引物用4uM
检测结果确定温度
二次PCr
用30ul体系
引物10uM
如果回收浓度要高就P俩个一起回收

作者: ilovegaga 时间: 2014-10-7 10:39

QUOTE:

原帖由 feima+ 于 2014-10-7 10:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

第一次PCr
用10ul体系，
温度分45，48，52，55，58
引物用4uM
检测结果确定温度
二次PCr
用30ul体系
引物10uM
如果回收浓度要高就P俩个一起回收

第一次pcr以cDNA为模板的。现在木有cDNA了。

作者: ilovegaga 时间: 2014-10-7 10:40

梯度也做过了啊 45-59℃的，帖子有图啊，引物二聚体严重是引物浓度太高了吗？

但是以cDNA为模板扩增时没引物二聚体啊？为什么以cDNA模板扩增出来的管液为模板时，引物二聚体这么严重呢？

作者: feima+ 时间: 2014-10-7 10:41

QUOTE:

原帖由 ilovegaga 于 2014-10-7 10:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

第一次pcr以cDNA为模板的。现在木有cDNA了。

_ _！你。。。。
你PCR体系是按标准加的么？？
我一次cDNA可以P很多次

作者: ilovegaga 时间: 2014-10-7 10:41

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原帖由 feima+ 于 2014-10-7 10:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

_ _！你。。。。
你PCR体系是按标准加的么？？
我一次cDNA可以P很多次

我要P六个基因，每个基因都P好多管...

作者: XYZQ 时间: 2014-10-7 10:41

引物稀释成原来的四分之一和八分之一试试其实pcr产物回收后够用就可以了不必太追求亮度

作者: ilovegaga 时间: 2014-10-7 10:42

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原帖由 XYZQ 于 2014-10-7 10:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
引物稀释成原来的四分之一和八分之一试试其实pcr产物回收后够用就可以了不必太追求亮度

谢谢你的建议。问题是，这亮度能回收吗？

作者: ilovegaga 时间: 2014-10-7 10:43

QUOTE:

早上重新做了次PCR，引物稀释1/4和1/8. 变性时间改为45s，退火时间没改。
跑胶看了下，条带都比以前亮。其中1/8的亮一点点。应该可以做回收。谢谢。

作者: ending 时间: 2014-10-7 10:43

可能是模板放太多

作者: ilovegaga 时间: 2014-10-7 10:44

QUOTE:

原帖由 ending 于 2014-10-7 10:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

可能是模板放太多

是的，模板多是其中一个原因，引物也是其中一个原因。引物设计得不是很好，引物二聚体严重。另外一个目的片段，同样二次PCR，模板更多，也能P出很亮的带。

不过还好，经过优化条件后，目的片段都能回收到。

非常感谢各位的帮助！

作者: gemei0115 时间: 2014-10-7 10:44

可以试试降低引物量增加模板量，另外就是可能你要P的基因本身表达量就不高

作者: wood533 时间: 2014-10-7 10:46

个人建议，仅供参考！
1.模板量适当减少，建议使用一次PCR产物0.05ul-0.1ul，引物/模板的浓度与产物的特异性呈负相关；
2.如果你能确定一次PCR产物是目的条带，并且所用引物非简并引物，退火温度明确，建议不采用梯度PCR方法，因为一次PCR产物（目的片段）作为模板，引物和模板退火良好，适当提高退火温度能增强目的片段的特异性，降低非特异性条带产生能力；
3.根据楼主的电泳结果，推测楼主使用的是10X loading buffer，强烈建议改为6X的，部分电泳结果如果用10X的buffer上样，会在1500bp左右出现假带；
4.建议PCR体系尽量别变，不同体积的反应体系在同一PCR仪里，会产生不同的结果，个人认为可能和导热速度及受热均匀情况有关；
5.楼主拍照的时候尽量调节一下曝光时间和光圈大小，图片有些模糊。

作者: flower@@ 时间: 2014-10-7 10:46

信息要给全面才好分析啊。。
引物序列
目的片段长度及G+C
pcr体系组成，其中模板浓度也要
跑胶的marker大小

作者: pou 时间: 2014-10-7 10:47

QUOTE:

原帖由 wood533 于 2014-10-7 10:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
个人建议，仅供参考！
1.模板量适当减少，建议使用一次PCR产物0.05ul-0.1ul，引物/模板的浓度与产物的特异性呈负相关；
2.如果你能确定一次PCR产物是目的条带，并且所用引物非简并引物，退火温度明确，建议不采用梯度PCR方法，因为一次 ...

稀释模板是正道

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