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标题: 【求助】在纯化过程中哪一步能大量除去内毒素？ [打印本页]

作者: ns5fan 时间: 2014-10-7 16:35 标题: 【求助】在纯化过程中哪一步能大量除去内毒素？

单抗三步纯化：Mabslect Sure、阳离子交换、capto adhere，内毒素检测一直不合格。想请教各位前辈其中那步能大量去除内毒素，操作中有哪些注意点？谢谢！

作者: 园丁## 时间: 2014-10-7 16:36

化学药中，活性炭吸附很有效果。。。

作者: tianmei001 时间: 2014-10-7 16:36

是的，不够详细，比如阳离子层析，内毒素一般都存在于穿透液中，不会和填料吸附。但不知道楼主的工艺中，阳离子层析收集的是穿透还是洗脱

作者: dodoit 时间: 2014-10-7 16:37

单抗三步纯化：Mabslect Sure、阳离子交换、capto adhere，内毒素检测一直不合格。想请教各位前辈其中那步能大量去除内毒素，操作中有哪些注意点？谢谢！

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记得之前看到原研药欧盟生产工艺的介绍，应该是protein A和阴离子交换

作者: ns5fan 时间: 2014-10-7 16:37

第一步亲和洗脱用pH3.8的柠檬酸缓冲液，阳离子收集洗脱液，离子梯度洗脱，最后过Capto adhere。要求内毒素低于10EU/剂量，但我们几乎每次都超标很多，有时高达12EU/mg。缓冲液内毒素为0.03EU/ml

作者: 101010 时间: 2014-10-7 16:38

1，应该说，每一步都能有效去除大部分内毒素。
2，哺乳动物细胞的发酵产物，内毒素水平本就不高；但抗体蛋白量很大，控制每剂量内毒素是有难度。但是12EU/mg，这个也太高了！！！
3，起始缓冲液合格，注意操作过程中的外源内毒素引入。
4，你应该检测每步骤前后的样品总内毒素水平（eu/ml，总体积），不要做到最后才测一下eu/mg。

作者: fangxiang 时间: 2014-10-7 16:38

GE的技术支持那边应该也能提供些参考意见吧。

作者: yyaxw84 时间: 2014-10-7 16:39

阳离子的流穿会去除大部分的内毒素，收集洗脱液的话应该没有问题。不过梯度洗脱，放大会比较麻烦吧。可以再优化下。同意楼上的观点，注意外源引入的内毒素。

作者: baidukk 时间: 2014-10-7 16:39

阳离子可以穿透内毒素，阴离子一般可以吸附内毒素，因为内毒素等电点较低。adhere 中就有阴离子交换基团，也会吸附内毒素。同意楼上所说，抗体表达不应该有这么多内毒素，注意环境和操作过程的控制吧

作者: baidukk 时间: 2014-10-7 16:39

实在没辙了就过一步Q层析，或专门去内毒素的填料

作者: bojitu 时间: 2014-10-7 16:40

不知道你的蛋白是怎样的，一般低电导偏碱性pH下，用阴离子的流穿模式去除内毒素的效果非常好的。一般我们的样品经过这一步后，内毒素都及格。阳离子的结合模式也能较多的去除内毒素，但是比较关键的是你每步所用的器具都应该去内毒处理（包括称量试剂的）（干热或者碱处理）。你们内毒检测是怎样的？一般我们的检测缓冲液是检测不出来的，要是缓冲液都能检测出来，一般就是操作过程污染了，控好这些内毒基本就没问题了。

作者: ns5fan 时间: 2014-10-7 16:40

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原帖由 bojitu 于 2014-10-7 16:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

不知道你的蛋白是怎样的，一般低电导偏碱性pH下，用阴离子的流穿模式去除内毒素的效果非常好的。一般我们的样品经过这一步后，内毒素都及格。阳离子的结合模式也能较多的去除内毒素，但是比较关键的是你每步所用的器具都应 ...

请问下在纯化过程中对水源有要求吗？是否非要用注射用水？我们一直用的是高纯水，内毒素<0.001EU/ml。

作者: greenbee 时间: 2014-10-7 16:41

我们用的也是超纯水，但是内毒检测是没有的（低于试剂最低检测限），所以有点好奇你们的内毒检测是怎样操作

作者: yueban-1147 时间: 2014-10-7 16:42

你每一步操作都留样检测一下内毒素，然后就知道你哪一步去除内毒素最多了。我记得我们有个产品亲和层析这一步内毒素去除最多。

作者: ns5fan 时间: 2014-10-7 16:42

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你每一步操作都留样检测一下内毒素，然后就知道你哪一步去除内毒素最多了。我记得我们有个产品亲和层析这一步内毒素去除最多。

我们是用湛江安度斯的鲎试剂（凝胶法）灵敏度0.25EU/ml半定量检测，也用过显色法（Thermo的）定量检测。你们的试剂检测限是多少？

作者: yueban-1147 时间: 2014-10-7 16:43

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原帖由 ns5fan 于 2014-10-7 16:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我们是用湛江安度斯的鲎试剂（凝胶法）灵敏度0.25EU/ml半定量检测，也用过显色法（Thermo的）定量检测。你们的试剂检测限是多少？

看来都是差不多的，我们也是安度斯，但是这个灵敏度0.25的怎么能检测到小于0.001的结果呢（
即便是定量法鲎试剂最低检测限也是0.005 EU/ml吧）

作者: ns5fan 时间: 2014-10-7 16:44

0.001是超纯水的出水标准不是我们检测的，我们定量检测PBS内毒大约0.03EU/ml

作者: chuntian1983 时间: 2014-10-7 16:56

层析三部都能除去内毒素，考虑哈填料CIP、SIP是否有效

作者: ha111 时间: 2014-10-7 16:56

楼主的蛋白等电点较高的话，可以考虑使用阴离子流穿模式，对去除内毒素的效果较好

作者: lixi559 时间: 2014-10-7 17:00

还是要从源头开始注意

作者: hold住 时间: 2014-10-7 17:01

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原帖由 lixi559 于 2014-10-7 17:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
还是要从源头开始注意

对头，如果起始收获液里面内毒素过高，后续工艺不一定都能清除掉。
此外，纯化工艺如果不是无菌操作，本身就能引进内毒素，这也是非无菌纯化中试的一个毛病。

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