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标题: 【求助】肝微粒代谢中NADPH和UDPGA溶液怎么配？ [打印本页]

作者: changlhsyo 时间: 2014-10-31 14:35 标题: 【求助】肝微粒代谢中NADPH和UDPGA溶液怎么配？

如题：大鼠肝微粒体代谢中的NADPH和UDPGA溶液怎么配？急用！谢谢！

作者: wood533 时间: 2014-10-31 14:37

NAPDH一般是买sigma的，UDPGA没买过。。。

作者: eric930 时间: 2014-10-31 14:45

实验室里NAPDH是用PBS溶解的，请问你自己制备微粒体吗？我的组织匀浆液（每克肝组织加上4倍的匀浆缓冲液）接近肉色（淡白色），超速离心后（10500g，70min）后，得到的上清也是有点红的颜色，弃上清，沉淀（肝微粒体，得到的颜色比较深，有点接近深红）用缓冲液继续悬浮，10500g，45min，弃去多余的上清液，用0.25M蔗糖溶液（接近6g肝组织加1.5mL蔗糖溶液），悬浮，-80°C保存。我得到的肝微粒体颜色比较深红的。是因为蛋白浓度偏高，所以颜色比较深吗？

作者: changlhsyo 时间: 2014-10-31 14:47

QUOTE:

原帖由 eric930 于 2014-10-31 14:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
实验室里NAPDH是用PBS溶解的，请问你自己制备微粒体吗？我的组织匀浆液（每克肝组织加上4倍的匀浆缓冲液）接近肉色（淡白色），超速离心后（10500g，70min）后，得到的上清也是有点红的颜色，弃上清，沉淀（肝微粒体，得到的颜色比较深，有点接近深红 ...

我的肝微粒是直接买的，我还没有自己做。你的NADPH是怎么配的？直接用NADPH，还是它的盐？

作者: eric930 时间: 2014-10-31 14:52

QUOTE:

原帖由 changlhsyo 于 2014-10-31 14:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我的肝微粒是直接买的，我还没有自己做。你的NADPH是怎么配的？直接用NADPH，还是它的盐？

NADPH一般用的都是它的四钠盐，我现在也在做这个，但是我买的NADPH不太稳定。你们买的肝微粒体是作为什么酶？我实验也用上肝微粒体酶

作者: changlhsyo 时间: 2014-10-31 14:55

我还没搞太懂，做I相代谢反应的。你的孵育体系是怎么配制的？

作者: yjf1026 时间: 2014-10-31 14:57

NADPH配制一般用你孵育体系所用的缓冲盐溶液（100mM的磷酸氢二钾缓冲液，磷酸调pH=7.40）；
孵育体系要看你是做I相氧化还是水解
氧化反应的话需要NADPH的参与供氢，具体孵育体系包括：酶，底物，NADPH，磷酸盐培养液
如果是水解反应的话，具体孵育体系包括：酶，底物，磷酸盐培养液，水解反应是不需要NADPH参与的
在此需要注意的问题是有机溶剂在你的孵育体系中体积不超过孵育总体积的1%
还有什么问题可以问我

作者: changlhsyo 时间: 2014-10-31 14:58

Originally posted by yhang at 2013-08-19 09:24:44
NADPH配制一般用你孵育体系所用的缓冲盐溶液（100mM的磷酸氢二钾缓冲液，磷酸调pH=7.40）；
孵育体系要看你是做I相氧化还是水解
氧化反应的话需要NADPH的参与供氢，具体孵育体系包括：酶，底物，NADPH，磷酸盐培养 ...

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做I相和II相反应的实验方法你有吗？这个方案我都定了好久了，一直没找到，I相的看文献上是这样反应：底物+肝微粒+磷酸盐缓冲液+NADPH再生系统（βNADP+,G-6-P,G-6-P脱氢酶和MgCl2）。II相反应是这样：底物+肝微粒+氯化镁+缓冲液+UDPGA ，但是市面上买的UDPGA都是没有活性的盐。

作者: birdfish 时间: 2014-10-31 14:59

不知道你指的实验方法具体是什么，II相反应如果是UGT酶的话是需要加丙甲菌素的，因为UGT位于细胞的内质网上，属于膜蛋白的一种
如果不破坏细胞膜，其活性相当地低，因此需加入丙甲菌素使其UGT从膜上破坏，从而提高活性。不知道你所谓的市面上买的UDPGA都是没有活性的盐是什么意思？会不会是由于你没加丙甲菌素导致你测不到UGT的活性呢？

作者: panda王 时间: 2014-10-31 15:04

我的肝微粒是直接买的，我还没有自己做。你的NADPH是怎么配的？直接用NADPH，还是它的盐？...

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你好，我想请问一下你的鼠肝微粒在哪个公司购买的呢？效果怎样？非常感谢！

作者: changlhsyo 时间: 2014-10-31 15:05

你好，我想请问一下你的鼠肝微粒在哪个公司购买的呢？效果怎样？非常感谢！...

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还没做哦，江苏齐氏买的

作者: ladyhuahua 时间: 2014-10-31 15:07

NADPH一般用的都是它的四钠盐，我现在也在做这个，但是我买的NADPH不太稳定。你们买的肝微粒体是作为什么酶？我实验也用上肝微粒体酶...

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你好，我买了Sigma的NADPH 4钠盐，是粉末状的，只有25毫克，我要测肝微粒体的P450，配成NADPH发生系统，怎么配啊？用什么溶液配，配成的溶度是多少？我看文献NADP+,G-6-P,G-6-P脱氢酶和MgCl2，用这四种配，我不会，就买了Sigma的NADPH 4钠盐，怎么配？请回答，谢谢

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