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标题: 【求助】生物样品的前处理-沉淀蛋白质 [打印本页]

作者: iii_ii 时间: 2014-10-31 17:34 标题: 【求助】生物样品的前处理-沉淀蛋白质

   书上讲的和一篇文献里讲的有些矛盾，但是我又是初学者不敢确定自己理解得对不对，想和虫友们讨论一下。
   生物样品进高效前都要经过前处理，在沉淀蛋白质时有一种方法是加入能与水混溶的有机溶剂。
   一、书上讲到
   “加入甲醇或乙腈后对血浆样品有一定的稀释作用，上清液中药物浓度会比原来低，且由于甲醇或乙腈的存在无法再用三氯甲烷、乙酸乙酯等有机溶剂萃取和浓集，甲醇-水（或乙腈-水）的混合液也很难挥干浓集，因此用甲醇或乙腈沉淀蛋白质直接进行测定的方法有时达不到反相HPLC测定灵敏度要求"。
   二、但是我在一篇文献上又看到
   '血浆样品为0.5 mL,加于聚丙烯离心管中;加入0·7 mL甲醇,手动振摇1 min; 3 500 r/min离心10 min;取上清液于另一离心管中,以0.5 mol/LNaOH调节pH至9;加入0.5 mL三氯甲烷,手动震摇10 min;然后以3 500 r/min离心10 min;取上清液,用0.5 mL三氯甲烷再提取一次后,小心弃去上清与氯仿层中间的变性蛋白层,合并二次的氯仿层, 40~50℃水浴挥干氯仿;在剩余残渣中加入500μL流动相,震荡使其溶解,过滤后上样。'
   文献里用甲醇做变性剂后继续用三氯甲烷来提取  是不是有问题啊

作者: wood533 时间: 2014-10-31 17:34

文献中的方法的样品最终是存在于氯仿层中，加甲醇是使蛋白变性，沉淀，加碱碱化游离，进入氯仿层，并不是和书中所说的加甲醇或乙腈沉淀蛋白直接进样。两者是有区别的。

作者: wanglaoshi 时间: 2014-10-31 17:34

书上讲的是对的，也是普遍适用的，但有时血浆中的杂质对测定有干扰采用一种方法预处理不能完全去除时会考虑采用多种预处理方法联用，这篇文献就是如此，即蛋白沉淀+液液萃取，通常情况下液液萃取很少加与水混溶的有机溶剂，但是有时会加一点来促进提取回收率，一般不加很多，否则该有机溶剂可能会分布到水相，反而降低萃取回收率，采用多少也跟萃取溶剂的种类和用量有关，所以这篇文献也没错，只要提取率灵敏度够高而且干扰少的话也是可以的。

作者: flower@@ 时间: 2014-10-31 17:35

为什么液液萃取前还要进行蛋白沉淀呢
推荐一个液液萃取的萃取液
正己烷-二氯甲烷-异丙醇（2:1:0.1），可在血浆中适当地加入1mol/L的碳酸钠，然后加入萃取液，涡旋，取上清吹干，流动相复溶，再高速离心一下；
根据药物的回收率调整萃取液的三者比例
一般能达到要求

作者: redbutterfly 时间: 2014-10-31 17:35

QUOTE:

原帖由 iii_ii 于 2014-10-31 17:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
   书上讲的和一篇文献里讲的有些矛盾，但是我又是初学者不敢确定自己理解得对不对，想和虫友们讨论一下。
   生物样品进高效前都要经过前处理，在沉淀蛋白质时有一种方法是加入能与水混溶的有机溶剂。
   一、 ...

哪本书上这么说过呢？
文献里的做法没错~

作者: iii_ii 时间: 2014-10-31 17:35

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原帖由 redbutterfly 于 2014-10-31 17:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

哪本书上这么说过呢？
文献里的做法没错~

傅强主编的药物分析实验方法学，人民卫生出版社的

作者: iii_ii 时间: 2014-10-31 17:36

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书上讲的是对的，也是普遍适用的，但有时血浆中的杂质对测定有干扰采用一种方法预处理不能完全去除时会考虑采用多种预处理方法联用，这篇文献就是如此，即蛋白沉淀+液液萃取，通常情况下液液萃取很少加与水混溶的有机溶剂，但是 ...

液液萃取的目的是不是为了更多地除去杂志保护柱子，还有就是提高提取回收率？有说是液液萃取反而会降低回收率，是这样吗？

作者: utt0989 时间: 2014-10-31 17:36

液液萃取和蛋白沉淀的提取率谁高谁低要根据药物决定，适当的萃取溶剂能是液液萃取的提取率接近100%，而水溶性很好的药物如果没有特殊的吸附，蛋白沉淀的提取率也能接近100%；一般选择原则：蛋白沉淀最方便操作，但是样品会被稀释，即会降低灵敏度，而且样品较脏；液液萃取稍麻烦，但是可以对样品进行浓缩，即提高灵敏度，处理后样品也比蛋白沉淀干净，具体选哪种方法还是要根据具体需要了

作者: iii_ii 时间: 2014-10-31 17:36

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液液萃取和蛋白沉淀的提取率谁高谁低要根据药物决定，适当的萃取溶剂能是液液萃取的提取率接近100%，而水溶性很好的药物如果没有特殊的吸附，蛋白沉淀的提取率也能接近100%；一般选择原则：蛋白沉淀最方便操作，但是样品会被稀释 ...

加入1mol/L的碳酸钠的作用是什么呀？

作者: utt0989 时间: 2014-10-31 17:37

Originally posted by 小珍珍 at 2010-05-19 00:41:00:

加入1mol/L的碳酸钠的作用是什么呀？

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这样血浆能更容易疏松

有利于提高回收率还有一方面是要根据药物的性质我做的是偏碱性的成分

你可以同时试试不加碳酸钠的

作者: join 时间: 2014-10-31 17:37

我感觉书上说的没错，一般都会出现这种现象的，加入甲醇或者乙腈会对浓度产生影响，然后再用氯仿等有机溶剂来萃取的时候，由于有效物质在甲醇和水构成的相—氯仿相两者之间的分配比例会产生差异，使有机相的萃取率不完全，产生一定的误差!

作者: xiaoxiaoniao 时间: 2014-10-31 17:37

学无定法，书行说的书针对他的实验，你的方法可以选择蛋白沉淀以后，可以氮气吹干，再加有机溶剂，补剂量浓度。这里最关键的是处理方法。

作者: iii_ii 时间: 2014-10-31 17:38

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原帖由 xiaoxiaoniao 于 2014-10-31 17:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
学无定法，书行说的书针对他的实验，你的方法可以选择蛋白沉淀以后，可以氮气吹干，再加有机溶剂，补剂量浓度。这里最关键的是处理方法。

谢谢补剂量浓度时什么意思啊？

作者: niangao1980 时间: 2014-10-31 17:39

书上讲的是对的，也是普遍适用的，但有时血浆中的杂质对测定有干扰采用一种方法预处理不能完全去除时会考虑采用多种预处理方法联用，这篇文献就是如此，即蛋白沉淀+液液萃取，通常情况下液液萃取很少加与水混溶的有 ...

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想请教下为什么加一点与水混溶的有机溶剂能提高提取回收率呢？

作者: niangao1980 时间: 2014-10-31 17:39

加入1mol/L的碳酸钠的作用是什么呀？...

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防止乳化，且在碱性条件下更易萃取，但是药物要在碱性条件下是稳定的。

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