分析测试百科

标题: 【求助】脂质体转染 [打印本页]

作者: zbboom 时间: 2014-11-3 17:38 标题: 【求助】脂质体转染

rt，脂质体转染

作者: shenkunjie 时间: 2014-11-3 17:39

我用的EGFP的质粒转染后12小时观察已经看见荧光,你指的空质粒是什么意思?具体是哪种GFP质粒啊?

作者: bgf5 时间: 2014-11-3 17:39

共转染应该和DNA的纯度和浓度有很大关系吧？一般我们在做的时候，老板都要求260/280在1.7~1.9之间，偏近1.8，否则就要重做。 DNA在加入脂质体的时候应避免出现气泡。在将混合液体加入培养细胞的时候应该是边加边摇，并尽快加入。自己的经验，不知是否正确，仅供参考。

作者: join 时间: 2014-11-3 17:39

什么细胞啊，有的细胞长的较慢，要过更长时间才能观察到绿色荧光

作者: flower@@ 时间: 2014-11-3 17:40

一般12小时后就能看到绿色荧光。至于得到稳定的细胞，至少需要1个月哦，这是很顺利的情况

作者: birdfish 时间: 2014-11-3 17:40

1，是否细胞再长多一点再转比较好； 2，你用的是不是罗氏的fugene系列？fugene对容器材质要求很高，而且要求不得分装，我有一同学把fugene分装后再转细胞就不行了。 3，抽的质粒跑过电泳吗？说实话，我对国产大抽试剂盒不甚放心。

作者: ladyhuahua 时间: 2014-11-3 17:41

请教一下，你的转染效率能有多大啊估计一下吧，谢谢

作者: dodoit 时间: 2014-11-3 17:41

你转染的，是什么细胞系呢？

作者: kuohao17 时间: 2014-11-3 17:42

老大，有没有筛过7721细胞啊？G418加多少才行？

作者: she 时间: 2014-11-3 17:42

那你的细胞可真牛！我筛的7721加到800，转染组的细胞就只有几小群蹲在板子角落里，不死也不长，真急死我了，恨不得加10倍血清给它喂饱！怎办呢？

作者: xiaoxiaoniao 时间: 2014-11-3 17:42

你是否用的刚构建的新质粒，如果是验证以下是否连接对如果质粒没有问题，你转的是何种细胞，有些比较难转

作者: wood533 时间: 2014-11-3 17:43

用脂质体做共转染，和磷酸盐共转染有什么区别？经典上使用磷酸该做的.请高手告知。

作者: zzzz 时间: 2014-11-3 17:44

你们谁做过GFP融合蛋白的稳定表达吗？谢谢！

作者: vvmmoy 时间: 2014-11-3 17:45

QUOTE:

原帖由 zzzz 于 2014-11-3 17:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你们谁做过GFP融合蛋白的稳定表达吗？谢谢！

做过的，用3T3、293细胞筛，挺好做的，在荧光显微镜、confocal下都能看到绿色，用抗GFP抗体做western也做的出来。只不过融合了目的蛋白后，荧光比单纯GFP要弱不少。

作者: wood533 时间: 2014-11-3 17:45

如果DNA用量不是太太多的话，做一次2L左右的大提应该就可以满足了。传统的酚/仿抽提就足以完成这样纯度的要求了，当然要记得消化RNA,呵呵

作者: hold住 时间: 2014-11-3 17:46

在转染的过程中怎样作到无菌啊，是在转染后加抗生素吗？

作者: ending 时间: 2014-11-3 17:46

脂质体转染前一定要好好看看PROTOCOL。我的体会是： 1、要保证质粒没问题。我前两次做的时候，目的质粒就没有表达，可对照的GFP没问题。反复查找原因，目的质粒重新测序才发现有突变。到现在我还没弄明白。只有重做克隆。 2、在做转染时，一定要加对照。 3、转染前要测质粒的纯度和浓度，这样才能做到心中有数。 4、无菌问题可以不考虑。质粒抽提时过柱，相当于已经抽滤了一次，在转染的操作过程中只要注意无菌原则就行了。我转染后的细胞还没发现有污染的情况。在转染后，按实验要求可以使用含抗生素的培养液。

作者: any333 时间: 2014-11-3 17:47

为了提高转染效率，应从以下几个方面下手： 1. 质粒的质量：用进口的去内毒素的质粒试剂盒，因为大肠杆菌产生的内毒素会影响转染效率 2. 脂质体： lipofectin为Invitrogen的产品，主要用于Stable transfection。Lipofectamine 2000用于瞬时转染效率最高。 3. 质粒和脂质体的量以及二者的比例很重要，有参考文献可以的话，参照文献（注：要那些高水平的杂志）如无，你可以先固定质粒的量，再摸索脂质体的量。 4. 转染前细胞融合率。 5. 转染用的液体，最佳推荐Opti-MEM® Reduced Serum Medium。一旦条件固定下来，不能更改，因这将影响实验的重复性。

作者: free 时间: 2014-11-3 17:47

为了提高转染效率，应从以下几个方面下手： 1. 质粒的质量：用进口的去内毒素的质粒试剂盒，因为大肠杆菌产生的内毒素会影响转染效率 2. 脂质体： lipofectin为Invitrogen的产品，主要用于Stable transfection。Lipofectamine 2000用于瞬时转染效率最高。 3. 质粒和脂质体的量以及二者的比例很重要，有参考文献可以的话，参照文献（注：要那些高水平的杂志）如无，你可以先固定质粒的量，再摸索脂质体的量。 4. 转染前细胞融合率。 5. 转染用的液体，最佳推荐Opti-MEM® Reduced Serum Medium。一旦条件固定下来，不能更改，因这将影响实验的重复性。

作者: free 时间: 2014-11-3 17:48

为了提高转染效率，应从以下几个方面下手： 1. 质粒的质量：用进口的去内毒素的质粒试剂盒，因为大肠杆菌产生的内毒素会影响转染效率 2. 脂质体： lipofectin为Invitrogen的产品，主要用于Stable transfection。Lipofectamine 2000用于瞬时转染效率最高。 3. 质粒和脂质体的量以及二者的比例很重要，有参考文献可以的话，参照文献（注：要那些高水平的杂志）如无，你可以先固定质粒的量，再摸索脂质体的量。DNA在加入脂质体的时候应避免出现气泡。将混合液体逐滴加入细胞内，轻晃混匀，培养6小时，在将混合液体加入培养细胞的时候应该是边加边摇，并尽快加入。 4. 转染前细胞融合率，每种细胞都不同。 5. 转染用的液体，最佳推荐Opti-MEM® Reduced Serum Medium。一旦条件固定下来，不能更改，因这将影响实验的重复性。

作者: qiangren789 时间: 2014-11-3 17:48

G418筛7721浓度380ug/ml够了

作者: qqq111 时间: 2014-11-3 17:49

筛7721加到G418 380ug/ml可以了

作者: wood533 时间: 2014-11-3 17:49

请问有没有做过EGFP转染原代培养细胞的？若转染，难度大不大，应该注意哪些问题？

作者: bgf5 时间: 2014-11-3 17:50

哪位高手用过Qbiogene的脂质体?效果如何?

作者: uaubc 时间: 2014-11-3 17:50

Qbiogene的脂质体叫什么shuttle吧，听一个国外回来的老师说过，对某些细胞株来说它的效果更好些，不过忘了是什么细胞了。

作者: leifengta 时间: 2014-11-3 17:50

看了这么多我也没整明白，你们是动物细胞吗？我们用的是昆虫细胞

作者: seagate 时间: 2014-11-3 17:50

我的也怪怪的！！

我也是转了pEGFP，它怎么也没有绿色荧光出现啊，我还是稳定转染呢！！
这个空质粒照道理应该是可以出现绿色荧光的，但是我的为什么啥都看不见！
真是恼火！

作者: linlinstar 时间: 2014-11-3 17:51

我转HEPG2 也没有看到绿色的荧光

作者: gemei0115 时间: 2014-11-3 17:51

有谁做过两种以上质粒的共同转染？请介绍经验。多谢

作者: kulee 时间: 2014-11-3 17:51

可以直接打老鼠试试看，不一定做细胞啊/

作者: rfv 时间: 2014-11-3 17:52

各位高手，请教一个问题，
我用INVITROGEN 的lipofectamine2000转染Vero E6细胞，但是效率很低，很郁闷，能否提高对Vero E6细胞的转染效率，多谢！

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)