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标题: 【求助】养细胞经常无缘无辜的染菌？ [打印本页]

作者: zbboom 时间: 2014-12-4 16:06 标题: 【求助】养细胞经常无缘无辜的染菌？

我是一个新手，但已养细胞近半年，最近一段时间经常染菌，有时是培养基，有时连原因都找不到，在实验中我也非常小心，但结果总让我伤心。现在都有点神经质了，请各位指点

作者: join 时间: 2014-12-4 16:06

你这个问题说大不大，说小也不小。说不大呢，七个字就可以回答你：严格按照无菌要求。说不小呢，这无菌要求的话匣子一打开太大。还是简要吧：1.将试验用品放入超净工作台用紫外线照射30分钟；2. 照射30分钟后，进入缓冲间，换灭菌的无菌衣，换专用拖鞋；3.手部用5％的洁尔灭浸泡2分钟，进入洁净区后，用75％的酒精棉球再次擦拭裸露的手部。4.最好戴口罩；5.操作时尽量靠近火焰；6.装培养基的瓶子等不要直接口向上，用一个架子斜放，瓶口朝向火焰；7.标准操作，不要让无菌吸管到处碰来碰去；8.中途出入无菌室，再次操作时，一定要再次用75％的酒精棉球消毒。一下也想不了那么多，具体的你再问吧。最好把你怎么操作的过程描述一遍，我们就好针对性的指出错误了

作者: yhz1973 时间: 2014-12-4 16:07

建议你把细胞室，好好清理一下，污染是这样的，出现一次就比较麻烦，千万别急。，还有，你们的紫外灯没有问题吧？

作者: zbboom 时间: 2014-12-4 16:11

非常感谢楼上的回信，在操作中我也严格按照无菌要求去做，因为操作台是公用的，而其它同学很少染菌，我想主要问题应在我身上，但是又找不到主要原因。我一般是这样操作的：紫外照后，用酒精棉檫拭手部开始操作，基本步骤是吸培养液到方瓶，再在方瓶中吹打混合，按比例传代，有时吸管头部碰在培养瓶口，有时吸管口棉花塞的太紧或太松不好用，有时原因都找不到，请各位指点。

作者: dream2013 时间: 2014-12-4 16:11

戴手套试试吧！

作者: ladyhuahua 时间: 2014-12-4 16:11

和楼主一样痛苦啊！！！刚调好状态准备铺板，又污染了！！！

作者: viviwang1987 时间: 2014-12-4 16:12

最好是涂片看看是什么菌？注意操作，吸管碰别处立即更换。污染是常有的事，也不必太给自己压力，熟能生巧。

作者: free 时间: 2014-12-4 16:12

你的滴管吸管进培养液瓶和细胞培养瓶前要在酒精灯上仔细烤一下，滴管不要反复用。其实无菌操作第一重要的就是你的超净台是不是还能用，滤网要及时清洗的。其次就是瓶口、滴管、移液器操作是过火的是否正确。还有一点很重要，手一定不能在任何瓶口上方经过！

作者: wanglaoshi 时间: 2014-12-4 16:12

从你操作的步骤来看，你的细胞应该是很好操作的。没看到你要用消化液，这就减少了污染的机会。你用的吸管是自己做的吗？经常练练，熟能生巧，时间长了，你就知道如何控制所塞的棉花量了。（用牙签或12号针头等工具来塞比较方便，塞完后用火将露出的部分烧掉再灭菌，这样就不会在上吸耳球的过程中，出现将棉花弄掉的情况），另外，你要勤剪指甲，不要戴首饰，吸管一周灭一次菌，不要没用完老用。

作者: abc816 时间: 2014-12-4 16:13

操作是导致污染的最主要原因

根据本人的经验，操作是导致细菌污染的最主要原因。本人以前曾经在一个相当严格的实验室工作过，那里的细胞室的要求是按照外科手术室要求的，更衣，换鞋，洗手，酒精擦手，戴口罩、帽子，所有培养液中加双抗，所有细胞操作器械专用；每天紫外灯照射40分钟后才允许进入。但是，就是这样的条件，操作不好，一样要污染。现在本人工作的实验室要求比那个实验室差的天远地远，但是只要操作仔细了，一样可以把最难养的细胞养好。本人曾经参观过一些名人进行细胞操作，也就是换上拖鞋，连工作服都不换就进细胞室，细胞一样没有问题。所以，最主要的是：工作服，尤其是袖口，消毒情况如何，袖口是否能够扎紧。如果不能保证，不如索性把袖口挽起来，把手臂用酒精擦一遍（其实我本人连擦都懒得擦，一样没事）。操作时，滴管两头都要烧。还有一点很重要，就是滴管头在加液体的时候，不要深入瓶口太多。在倒培养液的时候，可以拿起培养瓶直接倒，但是注意要倒干净，瓶口沾的最后一滴液体千万不可回流倒瓶内。还有一些基本的问题，比如瓶口要多烧一会，怀疑滴管有污染就一定要换。一旦细胞出现污染的迹象了，就一定要扔掉。如果实在想挽救，可以用一些高档抗生素（医院里给病人加药后的药瓶，用无菌盐水涮涮就能用，浓度足够），但要小心浓度太高细胞也会死亡。

作者: yes4 时间: 2014-12-4 16:13

看了这么多的回复，其实也没这么麻烦的，我想主要注意以下几点就可以了： 1、塞在吸管端的棉段在1cm以上，稍紧一点，如不熟练，最好再包一层牛皮纸或锡铂纸，干烤消毒比较好，140度二个小时以上； 2、注意台内布置，保持整洁； 3、每次操作前75%酒精擦拭双手（有的人不擦照样不污染）； 4、更重要的一点是：操作时双手或任何可疑的东西尽量不要在暴露的瓶口上方移动！！应绕道而行。一般污染多是不注意台内的层次感，其实这一点是很重要的； 5、找根本原因：向不污染的人要一些培养基或消化液什么的作作对照。这方面有问题多与我联系！

作者: bgf5 时间: 2014-12-4 16:13

注意培养瓶的瓶口，还有你的培养基、胰酶配好后都要划块血平板，到第二天，看看有无菌生长，如无菌，方可用，还有培养基、胰酶等过滤灭菌后最好用小瓶分装（100ml~250ml) 防止一但污染，损失和浪费就大了，还有操作用的器具都要高压灭菌。

作者: uuooii 时间: 2014-12-4 16:13

虽然我不长期从事细胞培养，但我曾经养过一次细胞，是成功的，楼上的高手都已经说了很多了，我想告诉你在取材时也应该严格按照无菌操作，在无菌工作台操作时请穿上一次性手术衣。祝你成功。

作者: PCR 时间: 2014-12-4 16:14

最好是涂片看看是什么菌？注意操作，吸管碰别处立即更换。污染是常有的事，也不必太给自己压力，熟能生巧。

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不能这样说哦，污染是可以尽量避免的虽然不是绝对我们实验室就快有一年没有被污染过了

作者: vvmmoy 时间: 2014-12-4 16:14

也有可能是细胞培养液出现了问题，最近我找到一个公司有即开即用型的培养液，我用了感觉还可以，价格也适中，要不你去试试。（这个公司网站：cuturl('www.genom.com.cn')）

作者: whitesheep 时间: 2014-12-4 16:15

污染源很难找，但是只要你遵循严格的无菌操作，说实话，想污染还不容易。我的经验是这样的。因为使用的是II级生物安全柜，所以也没有布置无菌室，我们就穿平时的工作服，但是要保持实验室的清洁是很重要的。操作前用新洁而灭认真擦一遍工作台，把要用的东西放上去，开紫外15min，关紫外后，吹风20min，这样子对操作者的身体危害可以减少。吸管装在布套中，布套可分为几格，卷起后包上牛皮纸，15P 30min,尽量做到每次使用前都灭菌，我都是每次灭几套。橡皮塞装在饭盒中，灭菌和吸管一样。枪头盒子包上牛皮纸，8P 30min。这些灭菌后都应放在37度的烘房中烘干，有水的话就容易染菌。枪在使用前用酒精棉擦拭枪头部分，酒精棉挤的干一点，买个枪架子，会方便的多。千万不要把枪的枪头部分朝上，容易污染。取出吸管时，手不要碰到旁边的吸管，也不要碰到包吸管的布的里侧，烧一下吸管的尾部，插上吸球，吸培养基到细胞瓶时，如果碰到细胞瓶的瓶口，（碰到其他东西也要换）一定要换吸管。打开培养基时，烧一下瓶口，不然污染了就心痛了。手不要经过开口的容器上方。实验做完了就要及时清理桌面，用新洁而灭擦一遍。目前想到的就这些了。

作者: 831226 时间: 2014-12-4 16:15

我培养的细胞曾经有多皿出现过真菌污染，后来听取他人意见，我把培养箱彻底用酒精消毒，然后在培养箱的底下的水槽中放上500毫升高压过饱和硫酸铜溶液以后在也没有出现过此中情况。无菌操作也很重要，只要严格的执行操作原则，我觉得问题不大。抗生素尽管可能只起安慰作用，但还是加一点好。

作者: zhy平平 时间: 2014-12-4 16:15

你还应该注意所用培养液的无菌。。。

作者: wawa 时间: 2014-12-4 16:15

请问培养箱应如何消毒,多久清洁一次?

作者: koook5695 时间: 2014-12-4 16:16

可以用新洁而灭水溶液擦洗，我不算勤快，但是一个月擦一次总是要的。

作者: bongte 时间: 2014-12-4 16:16

以我的经验平时注意一些关键地方就可以避免污染，不需要太紧张，操作越简洁细胞在外停留的时间越短越不容易污染，否则再仔细小心也说不定会染菌。一旦污染，就要将所有用过的瓶皿管等彻底严格的清洗消毒灭菌，如果可以更换就更好。培养箱也要清洗和消毒。另外，您说同组其他人没有问题，那你需要比较一下你们的主要差别在那里，如你的培养液和血清可能也都要更换，不要吝啬。另外，器皿未使用一周以上最好要重新灭菌。滴管头部碰瓶口后果下火就可以，但不可少太久。祝你顺利。

作者: dream2013 时间: 2014-12-4 16:16

个人的无菌观念是最重要的，只要怀疑有污染的吸管，就应马上丢弃。瓶口每次操作要经酒精灯烤灭菌。如果细胞总是污染，就要查查培养基或血清是否有污染，可以有培养基做一个培养以检查。细胞取材过程中也要注意无菌，如培养基没问题，检查一下取材的液体以及取材过程，特别是在手术室取材的要注意取材过程的无菌。

作者: junjie05 时间: 2014-12-4 16:17

我觉得污染的问题可能出在你的培养基和相关溶液上。一般来说，做了一段时间细胞培养的人，操作不会有太大问题，我们实验室操作仔细的有，豪放的也有，但染菌的机会平等。当然也不排除是先有鸡还是先有蛋的问题。

作者: ALALA 时间: 2014-12-4 16:17

我也认为是自己的操作的问题，没关系，只要注意一定会没问题的。我每次进无菌间所穿的白大衣都是经过高压灭菌的，在紫外灯开过后进入无菌间，戴帽子和口罩。操作时一定在酒精灯附近。

作者: greenbee 时间: 2014-12-4 16:18

其实细胞培养并不像人们所想象的那样进行严格的消毒设施。我在刚开始培养细胞时，尽管非常小心，但还是经常污染，那时真是搞得我都有点神经质了。经过一段时间操作后，现在几乎不污染了。我的体会是操作前一定要紫外消毒30分钟（超净台内），操作前用香皂洗手。液体瓶和培养瓶一定要斜放，吸管不可深入太多。瓶口一定要多烧，但时间不可太长。其它一些更换衣服，换拖鞋等措施我从没采用过。

作者: ALALA 时间: 2014-12-4 16:18

我也是正在郁闷中！我的问题是基础液的污染。做了几次，都污染！思前想后，出现问题绝对不是偶然的。正如楼上所说，刚开始做细胞时，都有点神经质了。我想污染的原因太复杂了，但是如果找不出原因一直做下去就更没有意义了。我觉得污染主要有两个方面：操作者和环境。操作者的个人卫生，操作之前酒精灯擦手消毒很重要。环境有超净台，CO2培养箱。另外还有高压消毒！特别是基础液的污染与高压密切相关。

作者: wood533 时间: 2014-12-4 16:18

我们的培养也都是经过抽滤除菌，没出现过污染问题。培养液最好一次用完，避免重复使用。

作者: nikonun 时间: 2014-12-4 16:19

大环境也很重要的，你的培养液等用液也要没有问题才可以

作者: bgf5 时间: 2014-12-4 16:19

做实验的时候，一定要把超净台擦干净，避免培养液撒出。
玻璃吸管泡酸过夜，清洗多次，烘干，用干热灭菌，160度，一个半小时。
培养箱半年或3个月用新洁而灭擦，再用75%酒精擦。有霉菌污染可在水盘中放饱和硫酸铜。

作者: loli 时间: 2014-12-4 16:19

楼主的问题我也常遇到,说说我自己的观点吧:
滴管口处的棉塞尽量不用脱脂棉,经常观察细胞,保证身体进入超净台的部分无菌!

作者: bgf5 时间: 2014-12-4 16:20

我也是深受污染的害，细胞死了N次。据说超净台有滤网，要定期更换。我试过用过氧乙酸把全实验室喷了一遍包括孵箱内，效果不错（呵呵，恰好就是“非典”时期污染的）。培养瓶消化一次后留少许细胞接着养我也试过，2－3次还行，多了就爱长别的东西，而且细胞贴壁情况好像也不太好了。

作者: tudou85 时间: 2014-12-4 16:20

我觉得这种情况，问题大多出现在细胞培养液上，可以从这里下手！！一些小的细节也一概注意！！

作者: zzzz 时间: 2014-12-4 16:20

我觉得放松心情也很重要，如果老想着怕污染，这种状态下是容易出错，也容易污染的。
在按规定操作的前提下，尽量放松心情也是个不错的选择！

作者: 04906 时间: 2014-12-4 16:21

各位大虾说得不错啊我刚开始做实验总是污染但是我现在没有了我觉得放松心情真得很重要

作者: www.1 时间: 2014-12-4 16:21

哈哈哈，偶在郁闷中～～～～就是因为该死的细菌，我现在从培养室到培养箱到细胞好好的整一整．靠！看看谁能折腾过谁谁！！！

作者: 831226 时间: 2014-12-4 16:21

我养细胞也是经常染菌，新手，特烦，实验都没法往下进行，换过培养液不到１２小时就变得没什么色了，过几天就会布满菌丝，那个郁闷呀！！！
看了各位的留言，我也要回去好好总结一下了。的确，在我的操作中存在很多问题。
谢谢了！

作者: vera+ 时间: 2014-12-4 16:21

我也是新手，不过刚开始做的时候一点儿事儿没有，可现在接二连三的污染。。。弄得我一没脾气！唉，无语。。。。

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