分析测试百科

标题: 【求助】 293T细胞用lipo2000转染后死亡很多 [打印本页]

作者: sunshine039 时间: 2014-12-5 15:19 标题: 【求助】 293T细胞用lipo2000转染后死亡很多

我的293T细胞状态不算差，但是连续进行了2次试验，lipo2000转染后细胞都大量死亡，飘起来的很多，不知道大家有啥好的建议？先说说我的具体过程。我用12孔板种的，汇合度达到了90%，质粒1.5ug，lipo20003.75uL（1:2.5）溶于opti-MEM200ul，在转染6h后拿出来看，细胞贴的还是较多，可是一换正常培养基，细胞就出现大量飘起，（我加的很温柔的啊）第二天拿出来看发现飘起的更多了，一团一团的全都浮着。在荧光显微镜下看却发现GFP是转进去了的。目前怀疑是不是含血清培养基要先预热，但是之前师兄做也没预热啊，他都没事。不知道是何缘故，明天还要再做一次，希望各位能给点指点，O(∩_∩)O谢谢！

作者: zwsyrt 时间: 2014-12-5 15:19

脂质体的转染毒性是最大的，很明显，那么多的细胞死亡是由于转染的细胞毒性导致的。对于这一点我有两个建议，一个是减少DNA的用量，我一般做转染，对于任何细胞，只要是12孔板，一般都是用1ugDNA，这个量绝对够了。,因为质粒转染进入细胞的本质，和病毒感染没区别，质粒的各种元件会从宿主细胞内抢夺细胞机器大量开始转录翻译你的目的蛋白，在这个过程中会产生大量的没有正确折叠蛋白，这些异常折叠蛋白进一步引起ER stress导致细胞凋亡。因此你用DNA太多，本身就有细胞毒性。另外就是脂质体本身的毒性。事实上，对于293系的细胞系，最好用的是PEI这种东西。毒性小，转染效率高，一般对293系列的细胞系可以轻易达到80%。polyscience有粉末买，买回来后直接在分子纯度的水里配置成1ug/uL的溶液，和你的质粒按照1ug DNA/6ug PEI对293进行转染。
而且直接使用自制的PEI非常便宜，在293上远比商品化的脂质体要好。

另外，如果你们实验室确实钱多，不怕花钱，建议你取用Promega的FugenHD,那个转染效率比脂质体更好，而且毒性小，至于价格。。。。。。。。。。。也更高。。。。。。。。。

另外，你说漂浮的细胞有表到GFP，那个不一定是真的GFP，很多时候细胞死亡后会在荧光显微镜下有非特异性荧光。

作者: youreyes 时间: 2014-12-5 15:20

293T本来贴壁就不紧，很有可能是吹起来的

作者: sunshine039 时间: 2014-12-5 15:20

更正一下，是293FT细胞。虽然它本来就贴不紧，也不至于几乎全部都吹起来了呀。con就是没转染的孔就没事哦。

作者: utt0989 时间: 2014-12-5 15:21

我们实验室转染后换液一般都预热，而且我也用脂质体2000转染，死亡细胞很少，所以建议你换液前将培养液预热30min-1h。我们还用另一种转染试剂，invitrogen公司的lipofectamine reagent 和Plus Reagent，这两个试剂必须搭配使用，我们做过预实验，它对细胞的毒性要比脂质体2000小的多，转染效率也高，你可以试试

作者: sunshine039 时间: 2014-12-5 15:22

谢谢你，给了这么详细的解答。我已经做完了，也成功了，主要改进了两个地方，第一，换液时一定要用预热过的培养基，第二，细胞铺板的密度要够高，至少90%。呵呵，很感谢你。

作者: sunshine039 时间: 2014-12-5 15:22

我已经做完了，也成功了，主要改进了两个地方，第一，换液时一定要用预热过的培养基，第二，细胞铺板的密度要够高，至少90%。呵呵，很感谢你。

作者: ladyhuahua 时间: 2014-12-5 15:22

我也要做转染了，不知道转染效率会怎么样。保佑！

作者: docsy 时间: 2014-12-5 16:02

我也要做转染，可是也是老是容易飘

作者: qqq111 时间: 2014-12-5 16:02

求教，293,293T细胞染色体数目是多少，一样吗

作者: junhun 时间: 2014-12-5 16:03

建议用Roche的X-trem Gene 9 or HP Transfection reagent,细胞不死转染效率高。针对293T贴壁不牢建议用 Poly D-lysine 将培养板或者培养皿处理，这样一般不会掉了。我前两天才用Roche的X-trem HP做过293T的转染，效率还高以至少60%~ 祝好
Lipo 2000大面积细胞会死亡的但是我前不久转一个难转的细胞发现它对那个一点杀伤力也没有但是也没有转进去。

作者: TNT 时间: 2014-12-5 16:03

你说的培养基预热时在培养箱里面预热还是在水浴啊？

作者: shenkunjie 时间: 2014-12-5 16:04

你好，我现在也是在做这方面，我遇到一个问题，看荧光的时候如果日光灯开着就看到绿色荧光，如果把灯关了就看不到了，不知道你有没有遇到这种情况

作者: qqq111 时间: 2014-12-5 16:04

多谢大家讨论！

我最近正在做MCF10A细胞系的转染实验呢，也是一片一片的死去 T_T 等会儿我再试试用高密度细胞转染，以及培养基预热。说的也是，转染过后的细胞极其脆弱，不如平时的时候抗折腾。

作者: misswu61 时间: 2014-12-5 16:05

你好，我现在也是在做这方面，我遇到一个问题，看荧光的时候如果日光灯开着就看到绿色荧光，如果把灯关了就 ...

===========================================================================================================

你那个有可能不是真的荧光……只是某反光物透过滤光片。你试试看用红色或者紫色蓝色绿光片是否都能看到它？荧光的话，通常情况下只要有激发光源（那个一般不太是日光灯），在全暗的情况能看到。

作者: shenkunjie 时间: 2014-12-5 16:05

换一下转染试剂试试，加我QQ727750080，免费试用美国SignaGen的转染试剂。

作者: zhenxin 时间: 2014-12-5 16:06

我转染时没有换成DMEM培养基，而是直接在FBS培养基中进行的转染，照样能够把效率提到90%。转染时细胞密度控制在60%~80&即可，不需要上面要求的90%以上

作者: zhenxin 时间: 2014-12-5 16:06

在补充一下，我用的是293T细胞

作者: 555444 时间: 2014-12-5 16:06

我想问一下大家，pCMV-myc这个载体可以在cos-7细胞中表达吗?选择在哪种载体里表达有啥讲究吗

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)