分析测试百科

标题: 【求助】 PCR结果只有引物二聚体 [打印本页]

作者: lixi559 时间: 2015-1-14 15:17 标题: 【求助】 PCR结果只有引物二聚体

以前p出来过的...
然后再p就p不出来了...只有很亮的引物二聚体
体系程序什么的都和之前一样...
重新提了模板还是不行，
体系是total 25ul
         Mix 12.5ul
         P1    1ul
         P2    1ul
         模板 2ul
         水       8.5ul

94 10min；94 1min ，55 1min ，72 90s，35个循环；72 5min

请问会是什么问题呢？

作者: 1472583690 时间: 2015-1-14 15:17

换个体系或者酶
一般我们最高就是20ul的体系
H2O：13.6、Buffer：2、Mg2+：2、P1/P2：0.4、dNTP：0.3、Taq：0.3、cDNA：1

作者: mingming0638 时间: 2015-1-14 15:17

mix，引物等完全溶解了

作者: lixi559 时间: 2015-1-14 15:18

用了两种酶都一样..不是越大体系的会越稳定？而且要割胶回收...20ul不够吧...这个应该不是关键的吧？

作者: lixi559 时间: 2015-1-14 15:18

QUOTE:

原帖由 mingming0638 于 2015-1-14 15:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

mix，引物等完全溶解了

什么意思？是指等到引物和mix完全解冻？

作者: xue258 时间: 2015-1-14 15:19

我们一般是50uL体系，质粒做模板的话不用加太多，只要质粒的质量够好，0.5uL和0.25uL我都成功过

作者: dragonkilly 时间: 2015-1-14 15:19

10ul的我都做过回收（加甘油），效果挺好的，没听说过体系越大越稳定的最近有个一样做PCR的怎么做都没扩出来，改了体系就扩出来了，只是提供一个参考而已

作者: kuohao17 时间: 2015-1-14 15:20

是啊，在冰上完全融化，要不然会成分不均匀，也有可能导致失败的

作者: rxcc33 时间: 2015-1-14 15:20

对啊。那你先不用mix做做啊。

作者: toy 时间: 2015-1-14 15:20

er...做那么大体系p不出好浪费酶...-0-....

作者: toy 时间: 2015-1-14 15:21

网上好像是有看过加甘油的..加的量是多少？
我是跟师姐做的，哈哈..她好像不太推荐太小的体系..
哦哦哦..我是引物没融全就把加了...
“取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的”有试过这个方法吗？

作者: toy 时间: 2015-1-14 15:22

er..我们实验室买的酶都是mix的..-0-..

作者: misswu61 时间: 2015-1-14 15:22 标题: 回复 #12 toy 的帖子

不至于吧？1uL而已......

作者: toy 时间: 2015-1-14 15:22

QUOTE:

原帖由 misswu61 于 2015-1-14 15:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
不至于吧？1uL而已......

我们用的mix的，是加总体系的一半....-0-....

作者: ALALA 时间: 2015-1-14 15:23

这应该跟体系的大小没有关系哦，可能是溶解不完全或者酶出来问题吧。

作者: toy 时间: 2015-1-14 15:23 标题: 回复 #15 ALALA 的帖子

恩恩，我也觉得...我觉得貌似是引物都自己连接了..有没什么可行的方法？网上看过一些...但是有些方法好像有点囧...-0-

作者: flower@@ 时间: 2015-1-14 15:23

甘油的话，用100ul的枪，好吧，我们叫枪，一般可加5管，一管一滴。至于你说的那种方法，我没试过。体系么，可能每个实验室的习惯不一样吧。P.S：PCR的过程有时候让人又爱又恨的，这很正常，耐心点，good luck~

作者: nut6694 时间: 2015-1-14 15:24

你再认真看看了，做实验细节至关重要了。如果再做还是那样的效果，那也只能死马当活马医了。

作者: toy 时间: 2015-1-14 15:24

那加的还挺多的啊..唉..今天还是做不出..明天试试那个方法好了...-0-...我的酶啊....两只都没多少了...上次p了个1500bp的也p得shi去活来的...

作者: toy 时间: 2015-1-14 15:24

和以前没什么区别，今天还做了两个梯度的..结果都没出.....还是只有又粗又亮的引物二聚体...这死马要怎么医...-0-...

作者: cocacola 时间: 2015-1-14 15:40

你看着加的挺多的，但是P完后没剩多少的。甘油，一般就10ul体系用的，20的话就不用的。PCR就是要细心，该加的东西不能少，该换枪头的要换，退火温度要摸索好的，东西都要在冰上完全融化。。。。。。实验么，慢慢来会比较快。

作者: toy 时间: 2015-1-14 15:40

哦...唉....耐心不了...因为之前p出来的过的，现在突然又不行了...-0-

作者: shenkunjie 时间: 2015-1-14 15:41

我这两天也是这个问题,同学说是引物的问题,我正在等新合成的引物到.

作者: toy 时间: 2015-1-14 15:41

我明天也拿新的引物试试...-0-...唉...杯具...

作者: XYZQ 时间: 2015-1-14 15:42

换dntp,换buffer，换酶，你全部都换掉，再做一遍，我觉得是某个出问题了，我原来跟你情况一摸一样

作者: baidukk 时间: 2015-1-14 15:44

我25体系的都快p一个月了,还是没有理想条带,都快疯了,看来毕不了业啦

作者: lixi559 时间: 2015-1-14 15:44

-0-...模板重新提取了，酶用了两种（酶是mix的），引物重新稀释过（引物二聚体那么亮，引物应该没问题吧），程序神马都试得很差不多了...

作者: lixi559 时间: 2015-1-14 15:45

-0-..你是什么问题？一个月，你用了多少酶啊....我也是毕业论文...唉..-0-

作者: zbboom 时间: 2015-1-14 15:45

我每次只p10个样品而已

作者: viviwang1987 时间: 2015-1-14 15:45

你用的rTaq酶吧？那个酶我做PCR的时候也是有时候能P出来，有时候P不出来

作者: hold住 时间: 2015-1-14 15:46

加甘油真的效果好么？上次我们这里有人家dmso，据说也是有一定效果的

作者: rxcc33 时间: 2015-1-14 15:46

你的是什么东东的pcr啊时间好长啊？？

作者: daod 时间: 2015-1-14 15:46

我也遇到过类似问题，建议把rTaq酶换成ExTaq酶试试！

作者: lixi559 时间: 2015-1-14 15:47

我同学一p就出来了，虽然条带很淡...-0-...

作者: lixi559 时间: 2015-1-14 15:47

只p1，2个的说

作者: lixi559 时间: 2015-1-14 15:48

我用了两种酶...我同学用rtap p出来了...

作者: kuohao17 时间: 2015-1-14 15:48

怎么这么像我的情况呢哎郁闷啊只p出来过一次然后再怎么做也只是引物二聚体了至今未解决啊

作者: toy 时间: 2015-1-14 15:48

我也不知道了...可能只是细节问题吧...-0-..做实验也是要靠rp活啊....

作者: mingming0638 时间: 2015-1-14 15:49

你的引物加的太多了，减半试试。

作者: toy 时间: 2015-1-14 15:49

哦哦哦...谢谢..现在已经p出来了，哈哈

作者: toy 时间: 2015-1-14 15:49

注意细节吧..感觉PCR就是这样..-0-

作者: toy 时间: 2015-1-14 15:50

就是注意细节吧，感觉..因为是我同学做的时候出来的，条件什么的也没变，虽然条带弱，但总算是有结果..-0-。。。

作者: zhenxin 时间: 2015-1-14 15:52

我们一般是25ul体系，p的效果蛮好的

作者: wiwi 时间: 2015-1-14 15:52

我P一个多月了还没出条带

作者: panda王 时间: 2015-1-14 15:52

MIX 挺好用的！

作者: 11_hjx 时间: 2015-1-14 15:53

以前，能P出来。现在不行了，最可能的就是引物降解，你的引物是用什么溶解的？

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)