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标题: 【求助】帮忙分析下PCR结果吧！ [打印本页]

作者: 小螺号 时间: 2015-1-14 16:51 标题: 【求助】帮忙分析下PCR结果吧！

大家好！这是我用菌落pcr产物跑的琼脂糖凝胶电泳图，恳请大家帮忙分析下出现这种情况的原因吧，谢谢！！

作者: october7 时间: 2015-1-14 16:51

都没有明显的条带出来，二号孔有一点。。不过算了吧。
首先，要做对照。检验体系是否有问题。
其次，有可能是菌落挑得太多，影响体系，回导致做不出来的。
最后，不知道你的引物有没有问题，一般没问题的

作者: 小螺号 时间: 2015-1-14 16:51

QUOTE:

原帖由 october7 于 2015-1-14 16:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

都没有明显的条带出来，二号孔有一点。。不过算了吧。
首先，要做对照。检验体系是否有问题。
其次，有可能是菌落挑得太多，影响体系，回导致做不出来的。
最后，不知道你的引物有没有问题，一般没问题的 ...

对照是什么意思，是不是不加模版的对照，还是阳性对照？请不吝指教！

作者: luoliqiong 时间: 2015-1-14 16:51

你也把体系和程序附上来啊，这样咋分析O(∩_∩)O~菌液PCR不好做，可以提质粒再做啊

作者: 小螺号 时间: 2015-1-14 16:52

QUOTE:

原帖由 luoliqiong 于 2015-1-14 16:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你也把体系和程序附上来啊，这样咋分析O(∩_∩)O~菌液PCR不好做，可以提质粒再做啊

PCR 反应程序: 94 ℃× 5min
                  94 ℃× 1min -- 56 ℃×3 min--72℃× 3 min, n = 35 次
                  72℃× 10 min

PCR反应体系为25μl:
   PremMix 12.5μl
   上游引物       1μl
   下游引物       1μl
   模板             2μl
   水          补至25μl（8.5μl）
请指教，谢谢！

补充内容 (2012-7-17 15:50):
目的条带为1468bp

作者: viviwang1987 时间: 2015-1-14 16:52

从电泳条带来看，不知道你目的产物片段大约是多少，如果较大的话，那么最前面不到100bp的应该是引物二聚体，另外，可以把退火时间稍微缩短一下，模板加1ul试试看

作者: viviwang1987 时间: 2015-1-14 16:52

对照是什么意思，是不是不加模版的对照，还是阳性对照？请不吝指教！

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可以做出来的对照~前提是你配置PCR反应体系的时候，是一起配置的，最后分成几份，才加进去DNA。。。这样的话，在同一条件下，若对照可以做出来，其他做不出来就可以判断不是体系有问题了，可以判断为：菌加太多，或菌落根本没有这基因。
若对照也没做出来：可以判断体系出问题了~~即配置的溶液，你操作出问题等等或引物降解，或PCR参数出问题了~~所以做对照很好哟

作者: tuomu45 时间: 2015-1-14 16:53

PCR 反应程序: 94 ℃× 5min
94 ℃× 1min -- 56 ℃×3 min--72℃× 3 min, n = 35 ...

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这个体系按照说明书，应该没问题的。。。

作者: 小螺号 时间: 2015-1-14 16:53

PCR 反应程序: 94 ℃× 5min
94 ℃× 1min -- 56 ℃×3 min--72℃× 3 min, n = 35 ...

===============

目的条带为1468bp

作者: 小螺号 时间: 2015-1-14 16:54

从电泳条带来看，不知道你目的产物片段大约是多少，如果较大的话，那么最前面不到100bp的应该是引物二聚体， ...

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目的条带为1468bp

作者: shenkunjie 时间: 2015-1-14 16:56

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原帖由 小螺号 于 2015-1-14 16:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
从电泳条带来看，不知道你目的产物片段大约是多少，如果较大的话，那么最前面不到100bp的应该是引物二聚体， ...

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目的条带为1468bp

其实你的菌液鉴定结果应该基本都是阳性，Marker2000 1000--2000之间的若隐若现的带应该就是，但是目的带太弱了，二聚体太强，可以把引物的量减半，模板增加一些。试试、

作者: 小螺号 时间: 2015-1-14 16:56

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原帖由 shenkunjie 于 2015-1-14 16:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

其实你的菌液鉴定结果应该基本都是阳性，Marker2000 1000--2000之间的若隐若现的带应该就是，但是目的带太弱了，二聚体太强，可以把引物的量减半，模板增加一些。试试、 ...

您好，我可不可以直接用PCR产物做模版，在跑一次PCR，谢谢！

作者: yjf1026 时间: 2015-1-14 16:57

目的条带为1468bp

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这样的话就可以肯定，你的目的片段没有P出来，给你两个建议：
1、确认template的浓度以及纯度
2、调整反应体系以及反应条件，做几个梯度看看，说明书上的都是理论的东西，实际操作过程中，会受到很多因素的干扰，所以说明书只能做一个参考，只有自己在实验过程中得到的数据才是最真实的。

作者: 小螺号 时间: 2015-1-14 16:57

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原帖由 yjf1026 于 2015-1-14 16:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
目的条带为1468bp

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这样的话就可以肯定，你的目的片段没有P出来，给你两个建议：
1、确认template的浓度 ...

您好，您说的做几个梯度是指什么梯度？具体说下吧，谢谢！

作者: qhyu 时间: 2015-1-14 16:57

目标条带分子量有点大，可采用其他PCR产品

作者: 小螺号 时间: 2015-1-14 16:58

QUOTE:

原帖由 qhyu 于 2015-1-14 16:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
目标条带分子量有点大，可采用其他PCR产品

其他PCR产品,能不能再指明点，谢谢！

作者: xue258 时间: 2015-1-14 17:04

就是有些PCR试剂盒嘛~~最普通的只是1000bp以内，中等的是1000至3000bp，长的3000以上~~具体好像罗氏的也有~~高保真之类的。。。不过你先试试最普通的啦~~

作者: qiangren789 时间: 2015-1-14 17:05

其实你的菌液鉴定结果应该基本都是阳性，Marker2000 1000--2000之间的若隐若现的带应该就是，但是目的带 ...

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不一定吧，如果我转化进感受态的话，假阳性是很多的~~那时郁闷死我，还好~~我只要一个阳性细菌就好了~

作者: u76mp 时间: 2015-1-14 17:05

一看跑出来的胶图片就知道你挑的菌落全部是阴性。。。。如果你的引物没有问题的话，还有模版加1微升就足矣！！

作者: yueban-1147 时间: 2015-1-14 17:05

引物已经形成二聚体了，丢那星星

作者: qqq111 时间: 2015-1-14 17:06

貌似全是引物二聚体呀

作者: glass 时间: 2015-1-14 17:06

对照是什么意思，是不是不加模版的对照，还是阳性对照？请不吝指教！

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一般阴性对照是要有的，阳性对照主要在摸索体系与条件时要的，pcr做多了就懂了。

作者: glass 时间: 2015-1-14 17:06

引物已经形成二聚体了，丢那星星

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您说的我不是太清楚，还请详细说下，谢谢

作者: jebel 时间: 2015-1-14 17:07

尽信书则不如无书，你把退火的时间缩短些，我们做的时候没你的那么长的，我们一般是1min左右的。没有一成不变的实验方案，你自己调整一下，调整一下条件重新跑一下pcr。可能就出现了的，我昨天跑出的条带和你的相似，那些条带应该是二聚体的。

作者: loli 时间: 2015-1-14 17:07

设计对照，检验引物质量
调整PCR条件（退火）

作者: xyw5 时间: 2015-1-14 17:07

感觉你的条带不是很明显你可以继续优化条件酶也可以用单个的我以前也用预混的结果不是很好还有设对照祝你好运

作者: mamamiya 时间: 2015-1-14 17:08

貌似有很模糊的母目的条带酶切看看吧

作者: leifengta 时间: 2015-1-14 17:08

不一定吧，如果我转化进感受态的话，假阳性是很多的~~那时郁闷死我，还好~~我只要一个阳性细菌就好了~

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我是说从楼主给的图片来看，虽然没有明显的条带，但在目的条带大小位置的，显然都是阳性。当然我不是说菌液鉴定都是阳性，呵呵不然何需鉴定。

作者: leifengta 时间: 2015-1-14 17:08

您好，我可不可以直接用PCR产物做模版，在跑一次PCR，谢谢！

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之前我们实验室有人那样做过，但是我不确定你那个P出来会是怎样，呵呵因为那个产物看上去太弱了~~

作者: zwsyrt 时间: 2015-1-14 17:09

在1000到2000之间好像是有条带的。只是很模糊。加个小提的质粒看看是不是那个位置，如果是的话那就优化一下条件吧。

作者: 小荷尖尖 时间: 2015-1-14 17:09

PCR 反应程序: 94 ℃× 5min
94 ℃× 1min -- 56 ℃×3 min--72℃× 3 min, n = 35 ...

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看了，你的反应条件，我总是觉得有点震撼，56度退火3min，时间也太长了吧，足够退火10wbp的片段了（当然，没人扩增这么长的片段）。我算路过，帮你优化一下反应条件吧：95度 5min（不是高CG基因组的话足够，对于普通酶，HOtstart的酶除外），94度 30s，63-58降落，72度1min（10循环每循环降0.5），然后94度30s，58度30s，72度1min（27个循环），加尾巴7min就够了。。。。要是还扩不出来，去检测模版，要不就重设引物，反正条件应该ok的

作者: toy 时间: 2015-1-14 17:09

我们最近做出来的也和你的类似，但是我们做的是大肠杆菌的mRNA逆转录成cDNA，引物是RAB12，大概是350个bp，我们做了梯度PCR，和PCR的产物作为模板，做不成来，继续进行了梯度，但结果还是和你的很像，如果知道原因请告诉我一声，谢谢

作者: 小螺号 时间: 2015-1-14 17:10

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原帖由 小荷尖尖 于 2015-1-14 17:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
PCR 反应程序: 94 ℃× 5min
94 ℃× 1min -- 56 ℃×3 min--72℃× 3 min, n = 35 ...

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您好，“94度 30s，63-58降落，72度1min（10循环每循环降0.5） ”这句话是什么意思，请指教！谢谢！

作者: vera+ 时间: 2015-1-14 17:10

菌落PCR关键是注意菌要少加，菌体对PCR有抑制作用。不要贪多哦，亲

作者: 小螺号 时间: 2015-1-14 17:10

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原帖由 vera+ 于 2015-1-14 17:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

菌落PCR关键是注意菌要少加，菌体对PCR有抑制作用。不要贪多哦，亲

我用沸水煮沸了15分钟，加了2微升，这个量多吗？

作者: youreyes 时间: 2015-1-14 17:11

引物太多了吧，加0.5微升试试。

作者: 小螺号 时间: 2015-1-14 17:11

引物太多了吧，加0.5微升试试。

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我加0.5试了，也是那样

作者: uaubc 时间: 2015-1-14 17:12

不是常规PCR体系和程序，前段时间使用TAKARA的高保真酶也是类似的方式，三步法的PCR程序，可惜没有扩增出我想要的条带，换用ROCHE的高保真PCR体系和常规程序结果很理想。

作者: 7437654 时间: 2015-1-14 17:12

引物设计肯定有问题

作者: tangxin_80 时间: 2015-1-14 17:12

菌落加太多的话上样孔里会很亮。56度退火时间太久了吧？一般是30S就够了啊。目的带是1.5kb的话延伸2分钟就够了

作者: 89tongzijun 时间: 2015-1-14 17:13

你这退火时间也太长了都3min了

作者: 89tongzijun 时间: 2015-1-14 17:13

延伸也不用3min吧应该是90s

作者: wanglaoshi 时间: 2015-1-14 17:13

94 ℃× 5min
94 ℃× 1min -- 56 ℃×3 min--72℃× 3 min, n = 35 次
72℃× 10 min

这个体系中94℃长达40min之多，我猜酶已经失活了！！除非你用的酶能够超耐高温，否则一般的taq酶早已失活。
如果你的菌落，引物均没有问题，建议用一下这个反应体系：

94 ℃× 3~5min
94 ℃× 20s -- 56 ℃×20s--72℃× 1.5min, n = 30 次
72℃× 10 min

注：一般taqE的扩增效率为1kb/min

作者: 831226 时间: 2015-1-14 17:14

引物二聚体很多,条带很暗,我觉得引物设计出现问题

作者: 小螺号 时间: 2015-1-14 17:14

引物二聚体很多,条带很暗,我觉得引物设计出现问题

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可是这个是网上的通用引物啊

作者: wanglaoshi 时间: 2015-1-14 17:15

因为引物二聚体的条带很大，正常条带几乎没有，因此正反引物可能在某些区间上匹配的概率很大，建议多设计些不同的正反引物，做PCR，选出最好的

作者: birdfish 时间: 2015-1-14 17:15

可能是引物加的太多，改为0.5试试看。还有，既然是菌落pcr，我不知道你的模板量是怎么测出来的，我平时做就是用白枪头粘一点就ok了，模板太多也会抑制pcr反应。

作者: greenbee 时间: 2015-1-14 17:15

都没有明显的条带出来，二号孔有一点。。不过算了吧。
首先，要做对照。检验体系是否有问题。
其次，有可 ...

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我是初学者，请问如何作对照呢？

作者: dongdongqiang 时间: 2015-1-14 17:16

一般PCR

作者: dongdongqiang 时间: 2015-1-14 17:16

一般PCR程序是95度5分钟，94度30s,56（根据引物退火温度来定）40s,72度1分钟(根据片段大小来定），72度充分延伸5-10分钟，你这个程序不太对吧，根据什么说明书来的？前面的都是引物二聚体，你重新来过吧，按我的程序试一下。

作者: yueban-1147 时间: 2015-1-14 17:16

我就想问一下为什么，那个退火和延伸时间怎么那么长啊，菌耶做pcr是可以的，一般不会出什么问题，但是那要看你有没有转化进去。还有就是你的pcr体系的模版加的太多了，0.5-1ul就行，还有就是要做对照

作者: PINK 时间: 2015-1-14 17:17

首先，PCR出不来结果原因很多，最常见的解决方法是首先，确定引物的正确性，第二，也是最重要的一点，退火温度进行梯度摸索，以确定最佳的退火温度，第三，还要在PCR的时候加一个阳性和阴性对照，来综合判断，这是我多年PCR的经验，希望可以给你一点启发！

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