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标题: 【求助】Ni柱分离纯化6His标签重组蛋白 [打印本页]

作者: +小生怕怕+ 时间: 2015-1-17 17:06 标题: 【求助】Ni柱分离纯化6His标签重组蛋白

本人用镍柱分离带有6个组氨酸标签的重组蛋白，缓冲液是20mM磷酸三钠、500mM氯化钠、10mM咪唑，洗脱缓冲液是250mM咪唑。经过几次层析后发现：我的目的蛋白都穿透了，没有挂住。。。请问大家，这是怎么回事呢？该咋办呢？谢谢！

作者: zhenxin 时间: 2015-1-17 17:07

我没理解你的穿透是哪种意思，呵呵
1，如果是250mM咪唑的洗脱液将你的蛋白洗脱下来的，这是正常的，250的咪唑就是为了洗脱蛋白
2，在10mM的情况下，蛋白就下来了，如果你的测序是正确的，那可能是蛋白的立体结构使His标签没有完全暴露在外，与Ni结合不紧密。

作者: +小生怕怕+ 时间: 2015-1-17 17:07

嗯，您说的这种情况很可能发生。那是不是也有可能和填料有关呢？

作者: zhenxin 时间: 2015-1-17 17:07

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原帖由 +小生怕怕+ 于 2015-1-17 17:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
嗯，您说的这种情况很可能发生。那是不是也有可能和填料有关呢？

可能与Ni柱的载样量有关系，只能挂住一定量的蛋白，剩下的都透过去了。
你们实验室还有人用Ni柱吗？问问他们载样量多大吧。

作者: +小生怕怕+ 时间: 2015-1-17 17:08

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可能与Ni柱的载样量有关系，只能挂住一定量的蛋白，剩下的都透过去了。
你们实验室还有人用Ni柱吗？问问他们载样量多大吧。

我用的是Chelating Sepharose Fast Flow，不知道这个填料怎么样啊？吸附效果是不是不是很好呢？

作者: DNA 时间: 2015-1-17 17:08

Chelating Sepharose Fast Flow哪个公司的?上海生工的停好用的.

作者: dmg 时间: 2015-1-17 17:09

呵呵，不同公司的填料吸附性是有差别的，你的不知道是哪个公司的？最好还是自己试一下，或者，问问别人的经验。呵呵

作者: +小生怕怕+ 时间: 2015-1-17 17:09

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Chelating Sepharose Fast Flow哪个公司的?上海生工的停好用的.

呵呵……GE的~~您用过么？

作者: +小生怕怕+ 时间: 2015-1-17 17:09

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呵呵，不同公司的填料吸附性是有差别的，你的不知道是哪个公司的？最好还是自己试一下，或者，问问别人的经验。呵呵

呵呵……GE的。不知道怎么样呢？

作者: +小生怕怕+ 时间: 2015-1-17 17:10

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呵呵……GE的。不知道怎么样呢？

呵呵，没用过这家的，大公司的说明书比较可信，你看看说明书上对吸附量的描述吧，它写多少，就是多少。

作者: kulee 时间: 2015-1-17 17:11

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呵呵……GE的。不知道怎么样呢？

呵呵，用这么好的填料，你们实验室挺强的吧？怎么没人懂蛋白纯化呀？

作者: kulee 时间: 2015-1-17 17:12

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原帖由 kulee 于 2015-1-17 17:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

呵呵，用这么好的填料，你们实验室挺强的吧？怎么没人懂蛋白纯化呀？

懂蛋白纯化的人很多，大家做的不是一个蛋白，而蛋白纯化又那么有个性，也有可能是我蛋白的事~~

作者: bluelake 时间: 2015-1-17 17:13

哥们，我也是这个柱子，你用大概多少填料啊，对应上样量大概多少菌液量呢

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