标题:
液相色谱含量测定,按照药典标准的波长测定无任何峰出现
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作者:
uwku58h
时间:
2010-12-13 13:34
标题:
液相色谱含量测定,按照药典标准的波长测定无任何峰出现
今天用
液相色谱
做感冒止咳糖浆中黄芩苷含量测定时碰到了难题
色谱条件:岛津10A的机子,N2000工作站,流动相是甲醇:水:磷酸(35:65:0.3),检测波长280nm,理论板不少于3000。
对照品配制:取黄芩苷对照品适量,加50%甲醇制成每1ml含15ug的溶液。
供试品制备:精密量取1ml,置50ml容量瓶中,加50%的甲醇至刻度,摇匀,过滤即得。 供和对各进10ul。
问题出现:第一针对照品,跑了一小时,没任何峰出现,就是基线。
第二针对照品,我把波长调到278,保留时间为22.998时出峰,不过峰形难看,而且理论板数只有600多。。。
第三针对照品,把波长调到276(因为之前我测黄芩药材黄芩苷含量时用的波长就是276),但保留时间变成31.082???理论板数同2针
第四针对照品,把波长调到279,保留时间为34.673??理论板数同2针
第五针对照品,把波长再调至276,保留时间为22.948??理论板数同2针
我昨天做了样品,系统应该是没问题的,对照品溶液也是新配的!!!
问题1:为什么按照药典标准的波长测定无任何峰出现(当然进样也没问题)?
问题2:为什么改变波长会造成保留时间改变这么多?
问题3:为什么柱效这么差?(我用的柱子才用2星期,而且之前所做的样品柱效都不错)
现在都没法做下去了,到底是哪些方面的问题???大家帮忙看看!!!
作者:
小莲
时间:
2010-12-13 18:07
标题:
回复 #1 uwku58h 的帖子
快被你气死了,有你这么做实验的吗,你的这些变动除了让实验变成猜谜游戏外毫无意义。276nm到280nm,吸收差别会大到276有、280就一点也没有的地步吗。保留时间不确定跟波长没关系。
固定一个波长,先做系统重复性实验,至少连续两针表现一致,再改变条件(增加有机相比例)使理论塔板数达标。
或者,以先保证能出峰为思路,先用90%的甲醇走一针(如果没峰就可以怀疑是波长选择问题或者是样品浓度问题),然后逐渐加大水的比例,使有关物质获得分离。
作者:
ccf335
时间:
2010-12-14 10:28
建议在276下连续进样试试,不要每进一个都换波长,因为换了检测波长,无法确定你检测到的色谱峰表达的是同一个物质。管路上有没有漏液,压力,流量正常吗?
作者:
uwku58h
时间:
2010-12-14 11:27
如果有很小的漏液(比如流通池有漏),系统会报警吗?选择在276下进样是不是因为药材是在276下检的?但是这改变了标准规定的测量波长,会对检测结果有大的影响吗?
在 276波长下进了三针对照品,保留时间分别为12.798、15.223、22.365,但峰面积相差无几的,为什么会这样?我测了下流速是正常的!!!然后我进样品,保留时间就更离谱了,直接45.658,我还以为不是呢,做了个加标,可以确认是目标峰,这究竟是什么原因造成的呢?
再者,我发现我今天做的系统压力比昨天的低了近20kgf(2MPa)[当然流动相比例也没变动],如果是有漏的话机子应该会报警,但运行是正常的,这又是什么原因?哪个地方磨损了?不密封???
作者:
ccf335
时间:
2010-12-15 17:49
276不是规定的检测波长吗?是不是色谱柱没有平衡好,或是样品污染很大,每进一次都有很大的污染,使用保留时间无法重复。
作者:
uwku58h
时间:
2010-12-15 17:50
第一、我今天打开空调再重新做了下,以前没开空调做的,室温大概是25度,以前室温只有差不多15度的样子,室温相差10度会造成系统压力有很大的改变吗?因为我没开空调的时候(15度)压力比开了空调(25度)高了近2MPa,只是流动相高了这么多,然而我冲洗柱子用的纯甲醇基本没什么变化,为什么会这样呢?
第二、我今天做的保留时间是45min(重现性也还不错),不过峰形不太好,峰高不高,不过理论塔板数比较高(毕竟保留时间这么长),而上几次做的怎么会在12.798、15.223、22.365的时间里出峰呢?是不是因为上针的没出来,而在下针出来了?因为我只在40分钟左右就停止采集了
第三、我做样用的波长是276,而药典规定是280,因为280没峰出,我这样改变规定波长做出来的结果可不可靠呢?(我是想反正对照品和样品是在同样的条件下做的,有影响应该会相互抵消吧???)
作者:
maomi530
时间:
2010-12-15 17:51
色谱条件:流动相是甲醇:水:磷酸(35:65:0.3),检测波长280nm,理论板不少于3000。
对照品配制:取黄芩苷对照品适量,加50%甲醇制成每1ml含15ug的溶液。
供试品制备:精密量取1ml,置50ml容量瓶中,加50%的甲醇至刻度,摇匀,过滤即得。
供和对各进10ul。
流速1.0ml/min
你的柱子的类型是不是错了 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的柱子试试!!!
作者:
uwku58h
时间:
2010-12-15 17:52
这怎么可能呢!!!!我实验室就只有一种柱子ODS,再说我做液相也有一段时间了,当然不会连C18柱都不认识。
作者:
yfdihdx
时间:
2010-12-16 11:04
楼主换瓶试剂,重新配制流动相试试,好好混合一下试试。
作者:
ruyue811211
时间:
2010-12-16 13:51
我也遇到过同样的问题:是单向阈漏了,你清洗一下单向阈,如果不行就换一个新的.
作者:
uwku58h
时间:
2010-12-16 15:42
单向阀漏了的话会造成流速发生很大改变吗?但我也没看到他漏啊?况且如果漏的话应该会报警吧?
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