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标题: 【求助】HPLC测试结果不一致,求解决方法 [打印本页]

作者: baidukk    时间: 2015-1-21 16:09     标题: 【求助】HPLC测试结果不一致,求解决方法

各位大虾,

小弟刚刚从事HPLC实验操作,不曾就遇见了一个比较杯具的问题,请各位给与支持和帮助。

我现在在做一个T3,C18的反向柱HPLC实验,结果在实验过程中,开始测定标准曲线的一些列浓度测定,一直到中间靠后的样品时均出现类似图1 的峰型,结果进行到后期,就出现了类似图2的峰型,前后如果同时吸取一管样品,也会这样。

图1为标准曲线的其中一个浓度-500mM,在HPLC开始时测定,刚平衡好柱子进行的第二管样品(该样品前已做BLANK,均没有这种峰出现)。
出现峰型如图1
图2为同样该管样品,只是在我试验将要结束时又跑了该管样品一针,图形变化较大。

纠结了很久,实验也做过重复,均是一样的问题。
请求帮助

作者: baidukk    时间: 2015-1-21 16:10

实验搞定, 试了很多方法,最后还是通过更换一下buffer,刚刚解决,还不知道是否稳定,先上来和大家分享一下,谢谢各位的帮助
作者: TNT    时间: 2015-1-21 16:11

你没说清楚,我觉得初步看是里面的两个成分。
作者: baidukk    时间: 2015-1-21 16:12



QUOTE:
原帖由 TNT 于 2015-1-21 16:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你没说清楚,我觉得初步看是里面的两个成分。

不是两个成分,如果是未酶解的,是不会在这个位置出现峰的,只有加了相应的酶才会有峰出现
作者: pengke1983    时间: 2015-1-21 16:12

图一样品可能过载,也可能液相方法学耐用性低。
作者: baidukk    时间: 2015-1-21 16:13



QUOTE:
原帖由 pengke1983 于 2015-1-21 16:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
图一样品可能过载,也可能液相方法学耐用性低。

图1与图2是从一管样品中吸取进样的,唯一不同的地方就是第一针在实验开始的时候,第二针在实验快结束的时候
作者: pengke1983    时间: 2015-1-21 16:15     标题: 回复 #6 baidukk 的帖子

第一针是否充分平衡?梯度还是等度?
作者: dior    时间: 2015-1-21 16:15

是不是样品溶液不稳定啊
作者: 6327555    时间: 2015-1-21 16:16

样品降解了,所以前面出现其他杂质峰
作者: bohe221    时间: 2015-1-21 16:46

要么你跑到后面柱子比较脏了,这种问题我也遇到过,尤其如果是中药。也可能是你样品本身就不稳定。建议把柱子冲洗干净后再做一次,样品的测定不要间隔时间太远
作者: eric930    时间: 2015-1-21 16:47

使用流动相溶解样品,或者高水相溶剂溶解样品
作者: rxcc33    时间: 2015-1-21 16:47

使用流动相溶解样品,加上保护柱。进样阀注意要时常清洗。
重复进样看看。

作者: dragonkilly    时间: 2015-1-21 16:48

哈哈 这个问题我遇到过 说说我的经验吧 有好几个办法:调节进样量,换流动相(估计你用的是国产的) 调节流动相比例 必要时重新做标准溶液 ,还有一个是 你的标准曲线用流动相稀释看看效果等等很多办法吧 流动相的ph 流动相的分离能力等等都需要考虑在内!

作者: yhz1973    时间: 2015-1-21 16:48

首先要用流动相配药,
还有你的药物浓度是不是有点高了啊

作者: milkdog    时间: 2015-1-21 16:48


楼主你走BLANK没有出现怪峰,说明仪器系统没有问题。
从楼主的描述来看,最大的变量是时间。不知楼主你的样品稳定性如何,在试验过程中是否要求控温。

作者: baidukk    时间: 2015-1-21 16:49

第一针是否充分平衡?梯度还是等度?

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平衡好了,因为是新柱子,我是过夜平衡的。是等度洗脱的
作者: baidukk    时间: 2015-1-21 16:49

样品降解了,所以前面出现其他杂质峰

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新配制的样品,不经过复杂的处理过程,直接加buffer稀释就可以了,应该不会是样品降解的,这个是标准液
作者: baidukk    时间: 2015-1-21 16:50

是不是样品溶液不稳定啊

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稳定的,是基本的buffer,样品平常都是保存常温的,只有配制好了之后才保存-20℃,我每次取一支,用完就丢掉了,不重复使用的

作者: baidukk    时间: 2015-1-21 17:11

要么你跑到后面柱子比较脏了,这种问题我也遇到过,尤其如果是中药。也可能是你样品本身就不稳定。建议把柱子冲洗干净后再做一次,样品的测定不要间隔时间太远

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这个是新柱子,而且后面出现的峰型才是我想要的,和我拿到的文献上的峰型一致,我想的是拿后面的结果

作者: baidukk    时间: 2015-1-21 17:12

使用流动相溶解样品,或者高水相溶剂溶解样品

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用流动相吗?我这个有个protocol的,是用的酶解样品的酶的buffer,这个buffer我单独跑过几次,没有影响的,而且我的流动相就是高水相的,就是水
作者: baidukk    时间: 2015-1-21 17:46

使用流动相溶解样品,加上保护柱。进样阀注意要时常清洗。
重复进样看看。

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流动相我的是低PH的,我怕会引起样品变性,不过也值得尝试一下,谢谢
作者: 8s5g    时间: 2015-1-21 17:47

是不是开始没有平衡好?溶液稳定性试验做了没?
作者: baidukk    时间: 2015-1-21 17:47

哈哈 这个问题我遇到过 说说我的经验吧 有好几个办法:调节进样量,换流动相(估计你用的是国产的) 调节流动相比例 必要时重新做标准溶液 ,还有一个是 你的标准曲线用流动相稀释看看效果等等很多办法吧 流动相的 ...

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我这个流动相很简单,是别人已经做出实验过的,就是单纯的水,用磷酸调节PH到2左右,,标准液我换过几次了,都是如此,而且阳性对照也是一样,实验到最后,不管是标液还是样品,还是对照,均出现想要的结果

作者: baidukk    时间: 2015-1-21 17:48

首先要用流动相配药,
还有你的药物浓度是不是有点高了啊

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嗯,我尝试一下用流动相配制标曲,浓度应该不是很高,我是有梯度的,从低到高都有的

作者: baidukk    时间: 2015-1-21 17:50

楼主你走BLANK没有出现怪峰,说明仪器系统没有问题。
从楼主的描述来看,最大的变量是时间。不知楼主你的样品稳定性如何,在试验过程中是否要求控温。

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没有特殊要求控温,我一般是进样器那边在8℃,柱温有一个,是柱子的要求,别的没啥了。
不过,我最近又试了一次,比如把前面做的一批样品,新进样一次,结果一模一样,也是开始时是m峰,后面变好,我纠结了

作者: jude    时间: 2015-1-21 17:50

样品不稳定,降解了……
作者: whitesheep    时间: 2015-1-21 17:51

1,我觉得可能是第一针进样时前一针有脏东西东西没洗出来,结果就进第二针了。从你的两个图型不一样就可以看出来,第二针主峰前面有一些峰,而第一针则没有,足以说明第一针是从中途开始记录信号的。
2,还有就是从出峰时间上看第一针的后面那个峰应该是你要的东西。你用的是不是同一根柱子。

作者: eor    时间: 2015-1-21 17:51

你的样品可能不稳定,有可能是因为光照或者温度的影响,转化构型了,
作者: baidukk    时间: 2015-1-21 17:51

1,我觉得可能是第一针进样时前一针有脏东西东西没洗出来,结果就进第二针了。从你的两个图型不一样就可以看出来,第二针主峰前面有一些峰,而第一针则没有,足以说明第一针是从中途开始记录信号的。
2,还有就是 ...

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是同一根柱子 同时制备的样品 同时测的 唯一的不同就是第一针和第二针间隔的时间比较长,中间有别的样品。你说的第一针有脏东西的可能性不大,我不是连续两针,从整个实验的中间部分开始 所有的都变好了。
作者: jiushikeshui371    时间: 2015-1-21 17:52

为何不再进几针看看效果?
作者: baidukk    时间: 2015-1-21 17:52



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原帖由 jiushikeshui371 于 2015-1-21 17:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
为何不再进几针看看效果?

进过很多次了,不同时间的重复也做过了,都一样的结果
作者: summerxx    时间: 2015-1-21 17:53



QUOTE:
原帖由 baidukk 于 2015-1-21 17:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

进过很多次了,不同时间的重复也做过了,都一样的结果

那你有没有换根柱子试一试,你最后进的时候是平衡了一下子进的还是直接接着上一针就进了?
作者: baidukk    时间: 2015-1-21 17:53



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原帖由 summerxx 于 2015-1-21 17:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

那你有没有换根柱子试一试,你最后进的时候是平衡了一下子进的还是直接接着上一针就进了?

没有换柱子  前天刚做过柱效了 柱子没问题  我是一起进样的  在开始之前 平衡了很久的柱子 一直到平衡了之后才开始试验的 用序列跑的 中间没有在平衡
作者: baidukk    时间: 2015-1-21 17:54

根据各位虫友的帮助,我现在用流动相作为样品处理buffer,结果标准梯度走出的峰型就正常了,同时也试了一下原来sample buffer配制标准梯度,还是出现双峰。那后面我测样品,样品需要酶处理,酶需要在buffer里进行,该怎么替换buffer呢?
作者: baidukk    时间: 2015-1-21 17:54

实验搞定, 试了很多方法,最后还是通过更换一下buffer,刚刚解决,还不知道是否稳定,先上来和大家分享一下,谢谢各位的帮助
作者: okhaha    时间: 2015-1-21 17:54

建议把柱子冲洗




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