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标题: 【求助】感受态与质粒转化 [打印本页]

作者: bluelake 时间: 2015-1-29 10:57 标题: 【求助】感受态与质粒转化

最近做感受态与质粒转化的实验总是长不出菌来。所用的菌是DH-5α，先按步骤制出感受态，接着在4℃冰箱中放12-14小时，再进行质粒转化。所用的标准质粒是6p-1，转化后的菌液是涂布在含有氨苄的平板上，并且设置了阴性对照与阳性对照，但是无论是实验组还是对照组都长不出菌来。所用的CaCl2也是重新配过的。请问这个问题是出在哪？

作者: hustwb 时间: 2015-1-29 10:58

那就是感受态有问题，感受态为什么要放4°冰箱，不放-80°呢？

作者: hustwb 时间: 2015-1-29 10:59

感受态的制备有问题吧

作者: flower-201 时间: 2015-1-29 11:00

感受态的制备过程都要完全无菌，我们有次装CaCl2的瓶子灭后没盖紧，之后感受态也是有问题。

作者: idoww 时间: 2015-1-29 11:02

你用是什么载体？抗性没用错吧？

作者: 1221 时间: 2015-1-29 11:03

感受态放四度那么长时间还能用吗？？？

作者: ztonyc 时间: 2015-1-29 11:03

制备感受态是个细活，一般实验室都不自制啦！都买现成的，可以保证效率的！
还有感受态保存时放-80,！

作者: memory 时间: 2015-1-29 11:04

制备感受态和转化就这点步骤的话那就步骤有问题啊，感受态细胞在4度防止时间在24小时内活性是会有一定的增加的，还有你转化过后就直接涂板应该是不行的，不是有一步是在预热的不含抗生素的培养基里37度摇培一小时左右后在收菌涂布的吧

作者: jiushikeshui371 时间: 2015-1-29 11:05

感受态我都是在4度放24小时再用，质粒转化效率应该很高的，这都很难说，一个小细节错误也许就败了。

作者: 66+77 时间: 2015-1-29 11:06

检查一下氨苄的浓度，是不是太高，我的是50-100微克每毫升LB。

作者: bluelake 时间: 2015-1-29 11:06

那就是感受态有问题，感受态为什么要放4°冰箱，不放-80°呢？

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那是因为做好了感受态接着就做质粒转化啊，放-80℃那不是又要活化吗？

作者: bluelake 时间: 2015-1-29 11:07

检查一下氨苄的浓度，是不是太高，我的是50-100微克每毫升LB。

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我用的也是50微克每毫升LB

作者: hustwb 时间: 2015-1-29 11:07

板没问题吧？？

作者: tieshazhang 时间: 2015-1-29 11:08

估计是感受态问题，我们都是做完感受态液氮速冻后放在-80，全程在4度或者冰上无菌操作。再说里面加甘油了，不到5分钟就化了，楼主为啥要放在4度？

作者: 小鱼鱼 时间: 2015-1-29 11:08

做感受态细胞的时候细菌活力很重要啊，一定要在对数期。

作者: shanzhapia696 时间: 2015-1-29 11:08

制备完感受态要放入-80℃保存啊，转化时取出来置于冰上自己融，然后就加质粒开始转化了啊，怎么还要活化？

作者: rxcc33 时间: 2015-1-29 11:10

不然去公司订几只感受态做一下，有保证，我们原来自己做，现在都是从公司订。正好也鉴别下是不是你的感受态的问题。

作者: gogo 时间: 2015-1-29 11:12

感受态现做现用吧

作者: bluelake 时间: 2015-1-29 11:12

估计是感受态问题，我们都是做完感受态液氮速冻后放在-80，全程在4度或者冰上无菌操作。再说里面加甘油了， ...

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我是做了感受态以后，接着就要做质粒转化，所以就没有放到-80℃保存，因为不是批量做感受态，而是放在4℃条件下12h，第二天做质粒转化，这样不行吗?一定要放-80℃吗？

作者: bluelake 时间: 2015-1-29 11:13

做感受态细胞的时候细菌活力很重要啊，一定要在对数期。

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摇菌一般也是过夜12h，应该菌的活力是可以保证吧？

作者: rxcc33 时间: 2015-1-29 11:14

制备完感受态要放入-80℃保存啊，转化时取出来置于冰上自己融，然后就加质粒开始转化了啊，怎么还要活化？

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制备好的感受态一定要放-80℃保存吗，即使不是批量做，第二天就要做质粒转化？-80℃的感受态取出来化冻就可以直接做质粒转化？转化率会下降吗？

作者: uaubc 时间: 2015-1-29 11:14

所有的过程就是注重细节，完善步骤。。。或许在无菌状态下可以再做一下。

作者: 49888 时间: 2015-1-29 11:15

怎么能放4° ？？？要放-80°啊！

作者: ha111 时间: 2015-1-29 11:15

我是做了感受态以后，接着就要做质粒转化，所以就没有放到-80℃保存，因为不是批量做感受态，而是放在4℃ ...

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那你放在-20都比4度强啊，感受态都是放在冰山融化，冰的温度多少，比4度低吧。这东西很矫情，尽量严格来做吧

作者: bluelake 时间: 2015-1-29 11:16

那个word 我下不来请发给我吧谢谢！

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什么word啊？

作者: toy 时间: 2015-1-29 11:16

根本就不是放置温度的问题，做好后24小时之内就用的话是可以放4度的，应该是感受态没做好，取1ml过夜培养的菌加入到100mlLB里边后摇2-3h就够了，如果是直接挑单菌落摇菌大概5h也行了，最好用大瓶摇保证里面的氧气充足

作者: bluelake 时间: 2015-1-29 11:17

QUOTE:

原帖由 toy 于 2015-1-29 11:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

根本就不是放置温度的问题，做好后24小时之内就用的话是可以放4度的，应该是感受态没做好，取1ml过夜培养的菌加入到100mlLB里边后摇2-3h就够了，如果是直接挑单菌落摇菌大概5h也行了，最好用大瓶摇保证里面的氧气充足
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可能真的是感受态没做好吧，不过前前后后做过很多次了，都没成功

作者: 33号 时间: 2015-1-29 11:18

QUOTE:

原帖由 bluelake 于 2015-1-29 11:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

可能真的是感受态没做好吧，不过前前后后做过很多次了，都没成功

看一下你的DH5α菌株有没有问题，最好能用原始菌株，而且不能是反复冻融过的，实在不行就买吧，还有可能是载体或连接酶等其他东西失活，不过看你的情况，这种可能性比较小

作者: ero11 时间: 2015-1-29 11:19

我用的也是50微克每毫升LB

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里面有甘油保存的话活化不是很快的事吗？

作者: bluelake 时间: 2015-1-29 11:20

看一下你的DH5α菌株有没有问题，最好能用原始菌株，而且不能是反复冻融过的，实在不行就买吧，还有可能是 ...

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菌在液体LB中可以长出来，就是做完感受态后做质粒转化，在固体LB（加氨苄）上涂板长不出来，而且没有氨苄的板上也长不出来

作者: nn255 时间: 2015-1-29 11:20

把各个条件在检查一遍！

作者: hyuu 时间: 2015-1-29 11:20

菌都不长这不是转化的问题

作者: xueyouzhang 时间: 2015-1-29 11:21

你的板确定好吗

作者: lixi559 时间: 2015-1-29 11:21

楼主放四度真是难以想象，感受态制备时要一直保持低温，冰上进行。感受态做好后最好液氮速冻，然后放负八十。转化的时候从负八十拿出来冰上融化。一直放四度的话还有效率吗？

作者: ztonyc 时间: 2015-1-29 11:22

应该是-80度吧！

作者: wiwi 时间: 2015-1-29 11:22

转化后，记得要在无抗的LB中摇1h左右，让质粒抗性基因表达。

作者: newway 时间: 2015-1-29 11:22

很难说，重新做一次吧

作者: changlhsyo 时间: 2015-1-29 11:23

应该是一楼所说，制备的感受态细胞出现问题……加入甘油后，短期可保存在-20℃冰箱中……

作者: zhenxin 时间: 2015-1-29 11:24

感受态要-80度保存，用时取出后立即冰浴，不能放在4度

作者: rxcc33 时间: 2015-1-29 11:25

感受态出问题了。

作者: 831226 时间: 2015-1-29 11:25

制备好的感受态一定要放-80℃保存吗，即使不是批量做，第二天就要做质粒转化？-80℃的感受态取出来化冻就 ...

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除非立刻要做转化，不然我们都会保存到-80℃。对啊，化冻就直接加构建的质粒了，按照转化步骤进行了。我们一直这样做的，所以不知道你说转化率的高低是与哪种方法进行比较呃。

作者: ladyhuahua 时间: 2015-1-29 11:26

是不是菌种不纯了呢？

作者: eor 时间: 2015-1-29 11:26

建议你还是买商品化的感受态吧，自己做的就算阳性能长出来，效率却未必满意，尤其连接效率不是很高的情况下更是明显，而且商品化的感受态也不很贵，最重要的是节省实验的时间

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