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标题: 【求助】细胞免疫荧光 [打印本页]

作者: misswu61 时间: 2015-2-24 00:04 标题: 【求助】细胞免疫荧光

以上是我做免疫荧光的结果，重复了好几遍了，最终效果都不好，那个前辈可以传授点经验。
我的实验步骤如下：
PBS洗，4%多聚甲醛固定20min,0.2%吐温20通透10min(膜受体），PBS洗
10%血清封闭30min,PBS洗,加一抗37℃孵育2小时，PBS洗2×2min
加生物素化二抗37℃孵育30min，PBS洗2×2min，SABC-FITC染色30min,PBS洗2×2min,DAPI染色5min
PBS洗2×2min,抗淬灭剂封片。倒置荧光显微镜拍照。
上面两张空白对照，下面两张为实验组。

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作者: summerxx 时间: 2015-2-24 00:05

透膜可以试一下这个0.25%Triton X-100,10min；一抗孵育改为4°C 6小时；另外抗体滴度是需要多摸索一下的

作者: misswu61 时间: 2015-2-24 00:05

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原帖由 summerxx 于 2015-2-24 00:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

透膜可以试一下这个0.25%Triton X-100,10min；一抗孵育改为4°C 6小时；另外抗体滴度是需要多摸索一下的

谢谢你的建议，我的目标蛋白是细胞膜上的，所以没有选择Triton X-100。一抗用的是1:100的

作者: misswu61 时间: 2015-2-24 00:05

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最烦人的是我的空白和实验显示同样的荧光，这让我怀疑我的全是非特异性染色。我把曝光时间调到了800ms才有现在看到的结果。

作者: 月牙牙 时间: 2015-2-24 00:06

你好，我也要做免疫荧光，之前没有做过，请问你做的时候是先爬片的吗？照相时需不需暗室或遮光啊？

作者: bangqi_k 时间: 2015-2-24 00:06

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原帖由 月牙牙 于 2015-2-24 00:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你好，我也要做免疫荧光，之前没有做过，请问你做的时候是先爬片的吗？照相时需不需暗室或遮光啊？

爬片，需要避光

作者: bangqi_k 时间: 2015-2-24 00:07

很明显，这不是膜定位，可以考虑抗体质量不行，或者串光了，你这个实验可以考虑不打孔，

作者: 911 时间: 2015-2-24 00:07

空白如此，要找找原因

作者: misswu61 时间: 2015-2-24 00:08

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我没有爬片直接在24孔板里面做的。拍照要避光，最好就是黑暗环境

作者: misswu61 时间: 2015-2-24 00:08

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原帖由 kent 于 2015-2-24 00:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我们做的时候是 0.2%Triton X-100 这个透化的时间不同细胞不一样，不透化效果也还可以。一抗我们做的是4度过夜，如果抗体结合效果不好可以先37度孵育1h后4度过夜。其他没什么了看你这个DAPI还可以可能是抗体的 ...

谢谢你的建议我4℃过夜做了一下同样的操作有时候能拍到荧光有时候不能，很是奇怪。而且荧光上比面图片好看多了，但不是很强

作者: misswu61 时间: 2015-2-24 00:08

很明显，这不是膜定位，可以考虑抗体质量不行，或者串光了，你这个实验可以考虑不打孔，

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你好，可不可以说一下不是膜定位的原因？

作者: misswu61 时间: 2015-2-24 00:08

空白如此，要找找原因

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我一直在摸索，现在我都怀疑是一抗了。不过也有可以我自己技术不行，忽略了一些细节

作者: bangqi_k 时间: 2015-2-24 00:09

膜定位应该是细胞周围一圈的，你也可以用一些膜蛋白抗体做个共定位

作者: gemei0115 时间: 2015-2-24 00:09

你自己都分析出来了，我不认为是实验操作问题，你的实验组和对照组的荧光效果来看是一样的，在膜上都标记上了，只能说明你的蛋白非特异，之前的实验组做的有问题，再就是你的抗体有问题，国产的？特异性低！

作者: misswu61 时间: 2015-2-24 00:10

你自己都分析出来了，我不认为是实验操作问题，你的实验组和对照组的荧光效果来看是一样的，在膜上都标记上 ...

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你好，我买的抗体是santa cruz的

作者: dreaming 时间: 2015-2-24 00:10

你的绿色亮点应该是非特异性的是不是二抗不好？

作者: misswu61 时间: 2015-2-24 00:11

QUOTE:

原帖由 dreaming 于 2015-2-24 00:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你的绿色亮点应该是非特异性的是不是二抗不好？

换了二抗结果还一样的

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