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标题: 【求助】用水都能PCR出条带来 [打印本页]

作者: 莓菓333 时间: 2015-3-10 17:20 标题: 【求助】用水都能PCR出条带来

最近做实验，很久都P不出来东西。经老师指导，换了一组pcr用的试剂。p倒是p出来东西来了，可是，在用水做空白对照组也出现特异性条带来。假阳性特厉害。后面我只用水做模板，加什么引物就出现相对应的特异条带。同时，我做了很多组实验，一种一种地换试剂，可是还是出现假阳性，就是找不出是什么原因来。请高人指点。我把电泳图跟大家看看

图中，左边第一泳道是BS2000 marker 第二泳道是LC3质粒及其对应引物p出的产物，第三、五泳道是G3PDH引物用水p出来的产物，第四、六泳道是LC3引物用水p出来的产物（区别在于水的来源不同）。请高人指点！！

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作者: xue258 时间: 2015-3-10 17:20

会不会是移液器或者吸头污染了

作者: star#room 时间: 2015-3-10 17:20

哎呀！跟我遇到的问题一样啊！我感觉有两个可能：一是气溶胶的污染，是不是你之前一直在做这个基因？第二可能是吸头的污染，现在有一种吸头是带过滤塞的，可以考虑用那样的吸头。我现在考虑的解决方案：实验前先把用到的吸头、移液器等材料在紫外灯下照射再实验。

作者: yes4 时间: 2015-3-10 17:20

嗯把你用的超纯水换一换试试

作者: tie8 时间: 2015-3-10 17:21

最关键的是酶和水，天根的酶还不错，直接买mix扩，里面有配套水，那个水是DEPC处理过的，引物千万别污染了，建议引物稀释成母液，取一点出来再稀释，若污染了就扔了，拔母液拿出来重新稀释，用mix加样污染的概率比较小，我都是拿个进口的1.5mL管子把mix、水和引物混合加好，涡旋离心就可以分装PCR管，注意在超净工作台里面加样，别乱讲话，小心唾沫飞进去，还有枪头、管子、PCR管子直接用进口的Axygen的不错，无需灭菌，价格也蛮便宜的，我解决1个阴性对照的问题都花了将近1个月，实验都这样子，有时找不到原因，祝你好运！

作者: one 时间: 2015-3-10 17:21

酒精擦拭移液器

作者: www.1 时间: 2015-3-10 17:21

我觉得是你的loading污染了

作者: 婴儿脸 时间: 2015-3-10 17:22

首先，好像和loading buff 没关系因为P初代不一样大，请问第二道也加水还是没加水，若加水了，为啥没P出3456的情况，这很可疑，如果加水了，没P出3456，不太可能是水污染；另外 3456P出来东西很浅，说明模板应该很少，应该是操作时有什么地方污染了吧，考察一下引物，另外就是2道与46道是一样大的，有什么地方交叉操作吗？我就推测这些，祝早日解决

作者: whitesheep 时间: 2015-3-10 17:22

试剂换换，试试吧

作者: 莓菓333 时间: 2015-3-10 17:22

QUOTE:

原帖由 xue258 于 2015-3-10 17:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

会不会是移液器或者吸头污染了

吸头都是灭菌的，移液器倒是没有照紫外

作者: 莓菓333 时间: 2015-3-10 17:23

QUOTE:

原帖由 婴儿脸 于 2015-3-10 17:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

首先，好像和loading buff 没关系因为P初代不一样大，请问第二道也加水还是没加水，若加水了，为啥没P出3456的情况，这很可疑，如果加水了，没P出3456，不太可能是水污染；另外 3456P出来东西很浅，说明模板应该很少，应该是操作时有什么 ...

第二泳道是有LC3质粒的阳性对照。

作者: 菠萝喵 时间: 2015-3-10 17:23

超纯水。。。

作者: free 时间: 2015-3-10 17:23

还是找到污染源吧，一个一个的排除。问问周围实验室有没有阴性对照做的好的实验室，排除气溶胶、移液器和水的问题。最后考虑引物的的本身污染，可以找公司重新合成。引物的问题我实验室碰到过。

作者: mamamiya 时间: 2015-3-10 17:23

照的好清楚哦~~也许是引物稀释的过程中出了问题，也许是枪头不干净吧

作者: seagate 时间: 2015-3-10 17:24

估计你们实验室有目的基因气溶胶了，可以试着换个实验室做一下试试，另外双蒸水最好小管分装后灭菌，注意避免药品之间的交叉污染

作者: @花开花落@ 时间: 2015-3-10 17:24

我们最近做了一个实验，灭菌后的超纯水都能P出来，很有可能是实验室水源的原因，你们的水定期做过检测吗？如果只做酸碱或细菌检测也是检测不到的必须要做一个支原体的检测。

作者: 66+77 时间: 2015-3-10 17:24

我PCR都是在超净台里做的一直都还好

作者: daod 时间: 2015-3-10 17:25

二聚体也会成倍数的递增的。

作者: yonger 时间: 2015-3-10 17:25

换引物吧，如果gapdh或者actin引物也出这个条带证明有问题，如果不是的话是不是引物的问题，引物而具体？

作者: IAM007 时间: 2015-3-10 17:25

建议楼主彻底换所有的试剂，你一个试剂一个试剂的试其实很浪费时间和精力，并且还不一定能找出哪个试剂污染了。
另外，空气和水污染也有很大的可能，你换了所有试剂后，建议操作的时候去别的实验室做一次看看，最好不同楼层的。我记得以前我读研究生的时候，为了防止气溶胶污染，老板甚至建议我去楼顶上操作一次！

作者: sr9971 时间: 2015-3-10 17:26

好像是污染了

作者: 1221 时间: 2015-3-10 17:26

（1）是不是上样电泳时没有换枪头；
（2）水中可能含有极其微量的微生物释放的DNA

作者: vera+ 时间: 2015-3-10 17:27

跑胶的Buffer是不是换换看看，电泳槽也可以清理下再泡泡！

作者: wanglaoshi 时间: 2015-3-10 17:27

1.可以考虑是不是你的引物收到污染了，可以弄一管新的从新做
2.水的来源是否可靠？是否仪器过久没有清理，让水有问题

作者: www.1 时间: 2015-3-10 17:27

换试剂，无菌操作

作者: 了了 时间: 2015-3-10 17:27

不是实验室气溶胶污染就是引物被污染了

作者: kuaizige 时间: 2015-3-10 17:28

考虑引物有无问题，重新合成在做看看

作者: 菠萝喵 时间: 2015-3-10 17:28

水，引物，枪头，枪，扩增管。。。都有可能污染啊。。。。看你这样的很有可能是水或者引物污染了。。。。先把水，枪头都灭了再试一试吧。。。还有的话基本上就是引物的问题了~~

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