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标题: 【求助】pcr求助 [打印本页]

作者: moonlight45 时间: 2015-4-2 11:20 标题: 【求助】pcr求助

各位大虾好，我再试验中遇到一些pcr困难，特向你们求助

我自己设计的醛固酮合酶(CYP11B2)引物
F AGCGAGTGTTGGGTCCTCTGCT

R GAAAGCAACCTGCGGTCACAGGG

通过NCBI Primer-Blast 比对结果如下Primer pair 1
Sequence (5'->3') Length Tm GC%
Forward primer AGCGAGTGTTGGGTCCTCTGCT 22 59.85 59.09%
Reverse primer GAAAGCAACCTGCGGTCACAGGG 23 60.48 60.87%

>NM_000498.3 Homo sapiens cytochrome P450, family 11, subfamily B, polypeptide 2 (CYP11B2), nuclear gene encoding mitochondrial protein, mRNA product length = 566Forward primer 1 AGCGAGTGTTGGGTCCTCTGCT 22Template 2209 ...................... 2230Reverse primer 1 GAAAGCAACCTGCGGTCACAGGG 23Template 2774 ....................... 2752

[ 本帖最后由 moonlight45 于 2015-4-2 16:34 编辑 ]

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=30582

作者: moonlight45 时间: 2015-4-2 11:21

有以下几个疑问
1 我设计的该引物的产物是否就一定是醛固酮合酶(CYP11B2）？
2 我在摸索退火温度时第2次有目的条带，但浅谈，确定Tm56度，再次提取细胞RT-PCR2遍均后无目的片段表达
3 产物二聚体严重，怎样改进？
4肯请同行指点疑问，如能提供更好的引物，万分感谢。

作者: vcve 时间: 2015-4-2 11:21

你好，我也不太懂，只能说自己的看法，你设计的引物合成的并非全长酶基因，仅是其中一段。引物很合适，与模板完全匹配，应该没有问题。Tm值56度也比较合适。如果换我可能选60-55度做一梯度，看看那个温度是最佳的。至于你说的引物二具体，可以不用管它。在尝试几次好了！

作者: abc816 时间: 2015-4-2 11:22

给lz几个建议，如果你按照ncbi的全基因序列设计引物的话，得到的应该改就是那个基因，用电泳检测带型大小与理论值相符就可以缺点他就是了，建议你再降低一下退火温度，最好做个梯度pcr，用nanodorp监测一下你的模板浓度，调整一下，另外你在加药的过程一定冰上进行，能减少一下引物二聚体的量

作者: october7 时间: 2015-4-2 14:23

引物二聚体一般不用考虑

作者: 2541 时间: 2015-4-2 14:26

二聚体先不用管它，先得到目的条带再说。二聚体的话可以调整一下退火温度，实在不行做个梯度吧--

作者: mickeylin 时间: 2015-4-2 14:27

二聚体确实没有用其他的不懂了

作者: dog002 时间: 2015-4-2 14:28

目的带很淡啊，片段不是很长，一般pcr条件下可以获得很亮的特异带，如果目的带很淡，不大能说明问题

作者: vvmmoy 时间: 2015-4-2 14:29

出现二聚体，很可能是引物加多了

作者: DCS 时间: 2015-4-2 14:29

你要是做的常规PCR，引物二聚体就不用考虑了，但是要做定量PCR的话就得把二聚体给消灭掉。一般是通过提高退火的温度，减少引物的量，增加模板的量，操作要在冰上进行，再个就是配置体系的时候要迅速，配好之后就直接PCR，中间最好不要间断，一点点个人经验。你的条带很暗，可能是模板的量太少了，也可能退火温度不适合，扩增效率低，做个梯度吧

作者: dior 时间: 2015-4-2 14:29

退火温度相差1度，P出的结果明显不？

作者: HOT兔 时间: 2015-4-2 14:30

用touch down跑跑看吧

作者: moonlight45 时间: 2015-4-2 14:30

感谢上面各位老师的热心，我现在首要的问题是想明确我设计的引物出来的产物是否就是我要的目的。我将继续尝试各位的提议，再次致谢。

作者: DCS 时间: 2015-4-2 14:30

你的Blast好象不完全，怎么只有1个相近序列呀，一般Blast都会给出一大堆近似的序列的。或者跟你选择的比较范围有关吧。
如果实在没有底，可以先按照国外的文献做一下，这样剩点事。

作者: gmt 时间: 2015-4-2 14:31

如果你只是做检测的话可以不考虑拿全长，那样的话可以把你已经跑出来的PCR产物做个二次PCR试试看，模板取1UL,如果条带可以的话就往下做克隆，然后送去测序看看你扩出的条带是什么。二次PCR可能产生点错配，但有时也不会，只是做检测的话影响不大。另外，条带很淡，可以考虑把模板量增大，做个梯度。将退火温度先降一点。二聚体先不用考虑。不过二聚体很明显，我觉得说明你的引物和模板量的比例不是太合适，所以引物都自己反应了。

作者: JK.jon 时间: 2015-4-2 14:32

感觉带还是不够亮，如果片段大小差不多的话感觉应该是目的片段，可以测序看一下啊

作者: iii_ii 时间: 2015-4-2 14:32

少加点引物，可以减少二聚体的量

作者: youyou99 时间: 2015-4-2 14:32

引物二聚体影响不大，如果出现了目的片段，可以把PCR产物稀释，做二次PCR，就会出现比较亮的条带。

作者: veiwu 时间: 2015-4-2 14:33

PCR时可以加点DMSO试试看！

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