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标题: 【求助】细胞培养基污染 [打印本页]

作者: 079777chao 时间: 2015-4-7 10:33 标题: 【求助】细胞培养基污染

培养液（无血无抗DMEM）37度摇床过夜，液面上漂有一层白色点点的东西，显微镜下可看到黑色块状的东西，各位看看这是什么

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作者: 079777chao 时间: 2015-4-7 10:33

图2~~~~~~~~~~

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作者: 079777chao 时间: 2015-4-7 10:33

图3~~~~~~~~~~~~~~

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作者: 079777chao 时间: 2015-4-7 10:34

图4~~~~~~~~~~~~~

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作者: 079777chao 时间: 2015-4-7 10:34

图5~~~~~~~~~~~

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作者: caihong 时间: 2015-4-7 10:36

如果培养基没有变浑浊，很大可能是真菌污染

作者: 079777chao 时间: 2015-4-7 10:36

可是如果是真菌，真菌比细菌大，细菌都没有，怎么会有真菌呢

作者: 079777chao 时间: 2015-4-7 10:36

我配培养基，养细胞什么的，都是万分小心，同学都说我都有强迫症了，实在想不明白怎么会污染，并且还不止这一次，前几次也有，加了抗生素就不会长了

委屈死我也

作者: qianqin1977 时间: 2015-4-7 10:42 标题: 回复 #8 079777chao 的帖子

你这看起来像霉菌污染，霉菌孢子比较难灭活，可以存活好几年呢，你几次污染有可能就是第一次污染以后没有处理完全，无过你用的是一次性的培养瓶的话，建议拧紧瓶盖，连通里面的培养液及细胞一起扔掉，如果用的是玻璃培养瓶之类的，建议拧紧瓶盖，高压灭菌，120℃，30-40min，然后再倒掉里面的培养液，洗干净，泡酸，洗干净，在高压灭菌后再用，一般不建议抗生素处理，因为处理不好的话有可能造成污染，孢子存活时间长、不宜灭活，孵箱的条件有适宜生长，那就极有可能持续污染的

作者: 079777chao 时间: 2015-4-7 10:42

不是的，我这刚配制的培养基，还没养细胞呢

作者: ns5fan 时间: 2015-4-7 10:43

你这个应该霉菌污染。

作者: whitesheep 时间: 2015-4-7 10:43

如果只是培养液的话，建议就别用了，换新的吧，培养液不要乱倒，倒进水池什么的都有可能引起污染，如果你放培养液的瓶子要重复利用，就还用上述我说的处理方法处理后再用，如果不用，直接连瓶子扔了，这样比较保险

作者: youyou99 时间: 2015-4-7 10:43

嗯，配培养基的盐水瓶是重复利用的，洗衣粉洗干净后，超纯水过三遍，瓶子晾干后，瓶口包好，170度干烤的，从升温到关闭3个小时，升温大概要40分钟，170度大概维持2小时零20分钟，这应该足以把孢子杀灭的呀

作者: dior 时间: 2015-4-7 10:44

但是你倒掉的培养液里的孢子没灭活啊，孢子会到处飘的，呵呵，我建议多加一步前面直接把有菌的培养液高压灭菌一遍，然后再倒掉培养液，洗瓶-泡酸-洗瓶-高压，这样的话不会对实验室其他的物品造成污染的，要不你只灭了瓶子里的，但大部分还是在培养液里的。

作者: yizhi 时间: 2015-4-7 10:44

以我的观点，最好不要使用抗生素，会使细胞产生抗药性。

作者: cj_mondy 时间: 2015-4-7 10:44

我们学校培养瓶大部分泡酸缸

作者: 079777chao 时间: 2015-4-7 10:45

细胞培养瓶肯定泡酸的，盐水瓶不泡酸

作者: hyuu 时间: 2015-4-7 10:46

养细胞最头疼了

作者: xevin 时间: 2015-4-7 10:46

消毒方法不对建议改正

作者: junhun 时间: 2015-4-7 10:49

建议你用一次性瓶子另外你这个是真菌污染真菌污染和细菌污染是没有关系的不是说先有细菌污染才会有真菌污染的这个概念你要分清

作者: shenkunjie 时间: 2015-4-7 10:49

这是孟加拉红培养基吗？？我做孟加拉红培养基的时候也有过这种情况，可能是倒平板的时候留的气泡吧

作者: milkdog 时间: 2015-4-7 10:49

霉菌污染

作者: #甜# 时间: 2015-4-7 10:50

细胞在这样的培养基中能够存活吗？

作者: 079777chao 时间: 2015-4-7 10:50

细胞多时貌似没什么影响，但是细胞少的话，就可以看到好多小黑点，细胞会死
前两天我又把摇过的培养液涂到LB平板和BHI平板上，什么都不长；
不确定是什么东西，

有师姐说是黑胶虫

作者: vcve 时间: 2015-4-7 10:50

培养基里为什么不加抗体呢？

作者: kulee 时间: 2015-4-7 10:51

看看你配培养基过程中使用的仪器是否干净，我们pH计的探头保护液时间长没注意，里面长了很多东西，一块一块的，培养基配了又配都没好转，发现后换了保护液，洗干净了探头，后来配的细胞就养好了

作者: veiwu 时间: 2015-4-7 10:51

我的培养基里面也有这东西，但是加血清之前没有。。。而且用着培养基养了24小时细胞后，它会自动消失，不影响细胞生长

作者: luoliqiong 时间: 2015-4-7 10:53

楼主可能是夏天养的细胞，夏天温度高潮湿容易霉菌污染

作者: JK.jon 时间: 2015-4-7 10:54

看哪样子不是霉菌霉菌是有菌丝的就是一般的细菌有点像酵母吧

作者: dog002 时间: 2015-4-7 10:54

一般用过的瓶子也要用铬酸浸泡过夜后，再用三蒸水冲洗三遍烘干，灭菌后烘干后才能用呢

作者: youyou99 时间: 2015-4-7 10:54

灭菌一般分两种,一种是干热灭菌,一种是湿热灭菌.干热灭菌一般建议是160~180之间的温度,灭菌2小时以上.这个时间是指持续2小时(不是说放瓶子进去2个小时,所以一些比较专业的烘箱或者说灭菌箱有一个时间功能,就是等箱子到设定的温度再计时.),而且是在160~180这个温度范围内.如果中间某些人开烘箱了,都可能造成灭菌不彻底.我觉得你这可能是干热灭菌不彻底造成的.
湿热灭菌一般就是高压灭菌锅进行.121度15~30分钟,取决不同的样品.

配置培养基配置的过程瓶子洗干净就可以了.过滤后装培养基的瓶子一定要做到无菌,一般建议湿热灭菌比较好.

作者: bs4665 时间: 2015-4-7 10:54

养细胞真是很麻烦，深有同感，自己配置培养基时怎样避免这些问题那？求解

作者: jude 时间: 2015-4-7 10:55

请问，如果用抗生素处理的话怎样还会导致污染那？？

作者: 黄花菜 时间: 2015-4-7 10:55

不建议用抗生素处理是因为，一般用抗生素的效果并不好，抗生素本身对细胞是有一定的毒性，另加上污染，如果处理的较为理想，控制住了污染的状况，但大多情况下细胞的状态达不到理想状况，会影响到后面的试验，还有就是根本不能控制住污染。
二、加双抗也跟细胞污染的程度有关，如果处于污染初期，就是细菌还没有成熟，没形成孢子，那还可以考虑试试用抗生素。但如果已形成孢子，就不用再试了，建议立即用我前面说的方法处理，孢子不好灭活，而且可以到处飞，如果你想着挽救，给别的造成污染的话，就得不偿失了，

作者: remenb 时间: 2015-4-7 10:55

自己配置培养基的话很可能是过滤的问题滤器的滤膜没有安装好就可能会污染我们实验室出现过这种情况不过都是细菌
我们的滤器都是安装好滤膜后高压灭菌然后再使用所配的培养基经过无菌实验时候再使用的

作者: wu11998866 时间: 2015-4-7 10:56

这应该是金葡污染建议到微生物科做鉴定

作者: vvmmoy 时间: 2015-4-7 10:56

我们养细胞的瓶子一般是要泡酸的……

作者: milkdog 时间: 2015-4-7 10:56

换批培养基试试。好运！

作者: bring 时间: 2015-4-7 10:57

我也遇到过，一个办法，全扔了，换一套新的，不要心疼

作者: veiwu 时间: 2015-4-7 10:57

会不会是血清里面携带的物品。。。。

作者: luoliqiong 时间: 2015-4-7 10:57

是霉菌污染啦，配培养基的时候，可以用0.22微米膜过滤3次就可以除得很干净，问题应该不是出在盐水瓶上面，另外干热灭菌可以用180度。

作者: 079777chao 时间: 2015-4-7 10:58

谢谢大家这么关心这个问题。已经解决了，其实这并不是污染，如果是生物类污染，培养基必定变混，变黄，但培养基一直都很澄清。
这只是pH值的问题，DMEM中含碳酸氢钠，需和二氧化碳才能维持pH值恒定，但菌检时，我把它放在摇细菌的摇床里了，缺乏二氧化碳，pH值慢慢升高，明显的紫色，致使DMEM中有杂质析出，漂浮在液面上。后来菌检都在CO2细胞培养箱里进行，就没有这样的问题了。
问题已经解决，绝对不是污染。

作者: 079777chao 时间: 2015-4-7 10:58

血清中有大量的蛋白，冻融和热灭能都会损害血清中少量蛋白，出现小黑点，这个我证实过，溶解之后、灭能之后在显微镜下都看到了小黑点，灭能后比灭能前多，所以血清不宜反复冻融，溶解过程以及灭能过程尽量要缓和，减少小黑点的出现。

作者: 079777chao 时间: 2015-4-7 10:58

配制DMEM，虽然含有碳酸氢钠，但它的主要作用是与培养箱中的CO2形成缓冲对，维持培养细胞时的pH值恒定，而不是像盐酸、氢氧化钠那样调节pH值。DMEM粉末+超纯水+血清+抗生素后pH大概在8.0~8.2之间，这时还需Hepes酸调节pH至7.2~7.4。

配制好的培养基应4度保存，切忌冻融。

作者: 079777chao 时间: 2015-4-7 10:59

DMEM粉末+超纯水+碳酸氢钠+血清+抗生素后pH值大概在8.0~8.2之间。
上一条忘写碳酸氢钠了

作者: 079777chao 时间: 2015-4-7 10:59

6. 血清之沈淀物 6.1. 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物，可用离心3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。
6.2. 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沈淀物的形成会显著的增多。有些沈淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“，但在37℃环境下，又会使此沈淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。

这条是我查到的，仅供参考。

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